南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

李 迅， 邓若冰， 王 飞*

(1.南京林业大学化学工程学院，江苏南京210037;2.江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏南京210037)

随着传统化学合成工艺带来的负面影响越来越受到人们重视，人类迫切需要找到绿色工艺来取代现有的工艺，以减少对环境的破坏.以生物酶类为催化剂的合成工艺可以很好地克服化学工艺的高能耗及高污染的缺陷，同时还具有选择性专一等特点，目前已应用于有机合成、手性化合物拆分和医药中间体等领域.脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)，也称羧酸酯酶(carboxylesterases)，它催化长链脂酰甘油水解为甘油、游离脂肪酸和单、双甘油酯［1］.

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，是一种优良的脂肪酶，CALB为催化剂的合成工艺具有低能耗、无污染、转化率高、选择性专一等优点，CALB没有界面活性［2］，有极强的立体选择性，且具有广谱的底物接受性，对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性［3-5］，因此具有很高的潜在工业价值，广泛应用于有机合成、手性化合物拆分和医药中间体等领域［6-10］.但商业化的CALB价格昂贵，如诺维信公司生产的Novozyme 435价格在300元/g左右，限制了其在工业化大规模生产中的应用.目前，CALB基因已成功被克隆，并在米曲霉(Aspergillus oryae)［11］、大肠杆菌(Escherichia coli)［12］、毕赤酵母(Pichia pastoris)［13］、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)［14］等宿主菌中实现表达，但 CALB在大肠杆菌中表达无法正确后修饰，其大多为包涵体［12］，而在酿酒酵母中容易过度糖基化而影响CALB活力［15］.而巴斯德毕赤酵母表达系统除了菌体生长速度快，表达量高，遗传稳定性好，分泌效率高等特点，而且自身分泌的蛋白较少，减少了分离纯化的成本［16］，本研究将 CALB基因克隆至载体pPICZ A和pGAPZ A中，转至KM71H中，筛选获得高效表达CALB的酵母工程菌株，并对重组酶的酶学性质进行初步分析.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 南极假丝酵母(C.antarctica，NRRL No.Y-7954)来源于美国农业研究菌种保藏中心.大肠杆菌(E.coli)DH5，毕赤酵母(P.pastoris)KM71H和质粒pPICZαA和pGAPZαA购自Invitrogen(Carlsbad，California，USA)公司.引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.1.2 试剂与仪器 对硝基苯酚辛酸酯(pNPO，4-nitrophenyl octanoate)，RNase A，氨苄青霉素(Amp)购自Sigma公司;Ex-Taq聚合酶，DNA ATailing试剂盒，限制性内切酶等购自TaKaRa公司;PCR纯化、低分子量标准蛋白质和提质粒试剂盒购自BIOMIGA公司;Yeast extract，Peptone购自 Oxoid公司.其余生化试剂和药品均为分析纯.

1.1.3 培养基 LB培养基、YPD和YPDS培养基等参考Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册.

1.2 方法

1.2.1 载体构建及酵母电转化 抽提南极假丝酵母的基因组DNA，以此为PCR模板，参照GeneBank上发表的南极假丝酵母脂肪酶B基因序列(Gene-Bank登录号:Z30645)设计两端特异性引物，上游引物:5'-CCCGAATTCGCCACTCCTTTGGTGAAGC-3’(斜线为EcoRI酶切位点);下游引物:5'-CCCGGTACCTCAGGGGGTGACGATGCCGGAGCAG-3’(斜线为KpnI酶切位点).(采用PCR方法扩增获得目的基因calb)PCR产物经EcoRI和KpnI双酶切后连入pPICZαA和pGAPZαA，获得重组载体 pPICZαA-CALB 和 pGAPZαA-CALB.重组质粒经Sac I线性化后电激整合入毕赤酵母KM71H细胞基因组中，涂布含抗生素Zeocin 100 μg/mL的YPDS平板，30℃培养48 h后，挑取单菌落于YPD培养基中进行培养.

1.2.2 CALB重组工程菌的筛选和表达 挑取单菌落接种于含体积分数5%三辛酸甘油酯的YNB为基础培养基的平板上，30℃培养箱中培养3 d以上，并每天补充100 μL甲醇至平板盖上，观察并选取水解圈较大的重组子接种于YPD培养基中培养，用于后续进一步诱导表达.

以pPICZ A为表达载体的毕赤酵母工程菌表达过程如下:用灭菌的竹签挑取单菌落接种于含25 mL BMGY培养基的250 mL摇瓶中，30℃、200 r/min培养至OD600为2～6，约24 h，严格无菌操作.在8 000 r/min下离心5 min，弃上清，将菌转入新鲜的BMMY培养基中，至OD600约为1.0，严格无菌操作，30℃、200 r/min恒温摇床培养96 h，每24 h添加一次甲醇至终体积分数为0.5%.12 000 r/min离心5 min，发酵液上清液即为粗酶液.

以pGAPZαA为表达载体的毕赤酵母工程菌表达过程如下:挑取鉴定正确的阳性单菌落至含有50 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃和 250 r/min的条件下振荡培养 96 h，12 000 r/min离心5 min，发酵液上清即为粗酶液.

1.2.3 CALB的高密度发酵 将筛选得到的高产脂肪酶基因工程菌挑取单菌落接种于BMGY培养基中摇瓶培养，再转接至大瓶BMGY培养基中培养，并作为发酵罐种子液.将种子液接种于发酵罐中，控制溶氧值DO为35%，自动流加氨水维持pH值为8.0，发酵24 h左右基础培养基碳源耗尽，DO迅速上升至90%，此时以40%的流速恒速补加甘油，直到工程菌OD600达到200，停止补加甘油.待甘油停加2 h后，开始进入甲醇诱导阶段，5 mL/h的速度流加甲醇，每小时以10%递增速度补加甲醇，直到10 mL/h的速度，维持此流加速度.培养至84 h.

1.2.4 测定方法 以pNPO为底物的分光光度法测定脂肪酶酶活.取100 μL适宜质量浓度的酶液(质量浓度控制在所测吸光度为0.1～1之间)和850 μL 的0.05 mol/L Tris·HCl(pH7.5)缓冲液混合，空白样则用缓冲液代替酶液的体积，预热5 min，加入50 μL 13.5 mmol/L pNPO 作为底物，在40℃准确反应5 min后，立即加入100 μL异丙醇终止反应.将反应液13 000 r/min离心5 min，取上清，在410 nm处测吸光值.一个酶活单位(U)定义为在pH7.5、40℃条件下，每分钟释放1 mol对硝基苯酚(pNP)所需要的酶量.蛋白质量浓度的测定方法采用 Bradford 法［17］.

1.3 酶学性质测定

1.3.1 最适温度和温度稳定性 分别在20、30、40、50、60和70℃下测定pNPO酶活，以确定重组CALB的最适反应温度.将适宜质量浓度酶液分别放在30、40、55和60℃下保温2 h测定 pNPO酶活，依次在 20、40、60、80、100 和120 min 取样，以确定重组 CALB的温度稳定性.将所取酶样按照1.2.4方法测定 pNPO酶活，酶活测定条件均为pH8.0和40℃，每个样品重复3次.

1.3.2 最适pH值和pH稳定性 分别在pH值为5～10的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液下测定pNPO酶活，以确定CALB的最适反应pH值.将酶液分别在不同pH的0.1 mol/L缓冲液(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 和 10.0)中 16 ℃条件下放置1 h后，在40℃，pH8.0的条件下按照1.2.4方法测定pNPO酶活，以测定CALB的pH稳定性，每个样品重复3次.

1.3.3 金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶的影响将酶与不同的金属离子(Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni+、Ba2+和 Co2+，5 mmol/L;体积分数0.1%SDS和0.05%Triton-X100)混合后常温放置1 h，然后取样在pH8.0值为和40℃条件下按照1.2.4方法测定pNPO酶活，对照样不加添加剂，其他条件相同，每个样品重复3次.

2 结果与分析

2.1 重组载体的构建 以南极假丝酵母NRRL Y-7954基因组DNA为模板，PCR扩增得到CALB成熟肽编码序列，PCR产物经EcoR I和Kpn I双酶切后连入 pPICZ A和 pGAPZ A，获得重组载体pPICZ A-CALB和pGAPZ A-CALB.重组质粒经双酶切(EcoR I和Kpn I)鉴定正确(图1)后转入毕赤酵母KM71H中表达.

2.2 启动子对重组CALB表达的影响 对比不同质粒pPICZαA(启动子为 AOX)和 pGAPZαA(启动子为GAP)对CALB基因在毕赤酵母中表达的影响，结果显示，以AOX启动子型的重组菌较GAP启动子型的重组菌具有更高的表达量和酶活，pPICZαA-CALB+KM71H重组菌培养4 d后酶活达11.11 U/mL，蛋白质量浓度为0.45 mg/mL，较原始菌中脂肪酶酶活(2.56 U/mL)高四倍多.而pGAPZαA-CALB+KM71H重组菌培养4 d后酶活仅为0.52 U/mL，蛋白质量浓度为0.020 mg/mL因此，选择AOX启动子型的重组菌(pPICZαA-CALB+KM71H重组菌)进行后续的研究(见图2).

2.3 CALB的筛选和高密度发酵 挑选三丁酸甘油脂平板中有较大水解圈的重组菌，将菌体保存于-80℃含有体积分数15%甘油的YPD管中，并对这些重组菌进行摇瓶发酵，测定脂肪酶活力，其中pPICZαA-CALB重组菌产脂肪酶酶活最高为42.90 U/mL，蛋白质质量浓度为0.51 mg/mL，比酶活为83.79 U/mg，较未筛选之前(见2.2)有大幅提高，并且酶活高于相关文献报道［15，18］.选择该菌株进行高密度发酵，培养至84 h，发酵液酶活可达179.19 U/mL，蛋白质质量浓度为1.36 mg/mL，SDS-PAGE蛋白电泳分析如图3，显示重组蛋白亚基为37 kDa，且目的蛋白的条带相对单一，可进行下一步脂肪酶酶学定性.

2.4 酶学性质测定

2.4.1 最适温度和温度稳定性 如图4(A)所示，CALB在40℃时酶活达到最大.在30～40℃范围内，保温60 min，重组CALB酶活都能保持70%以上，在55℃时，CALB酶活降低较快，保温60 min后残余CALB酶活为未保温样品的48.5%.可认为，该酶在在30～55℃范围内，能保持较高的反应活性，也有较好的温度稳定性.

2.4.2 最适pH值和pH稳定性 如图5所示，CALB在弱碱环境具有较好的活性，在pH值为8.0时，活性最高.在酸性条件下，酶活都低于最高酶活的30%.CALB的pH稳定性结果如图5(B)所示.在pH7.5～9.5之间的缓冲液中处理1 h后仍保持60%以上的水解活力，pH8.5时酶的稳定性最大，之后酶的稳定性呈下降趋势.该酶在酸性条件下稳定性较差，在pH为6.5以下保温1 h后基本测不到酶活.由此表明，CALB在弱碱性条件下具有较好的稳定性.

2.4.3 金属离子和表面活性剂的影响 不同的金属离子和表面活性剂对重组CALB的影响结果如图6所示，发现Zn2+对CALB的抑制作用最强，CALB酶活为未加金属离子样品的26.1%.Mg2+、Ni+、Co2+对酶活几乎没有影响;在 Ca2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+的作用下，脂肪酶的酶活都有较多的下降.非离子表明活性剂 Triton X-100(体积分数0.05%)可提高CALB的活性，而阴离子表面活性剂SDS(体积分数0.1%)对CALB的活性略有抑制作用.

3 结论

但由于CALB的高成本难以实现工业应用，本研究克隆CALB基因至毕赤酵母中进行分泌型表达，通过活性平板筛选和高密度发酵，无需经过纯化步骤即得到较高纯度的重组CALB，较高纯度的重组CALB比酶活达到131.8 U/mg.重组CALB最适反应温度为40℃，最适pH值为8.0，重组CALB在55℃范围内保温1 h，仍能保持48.5%的活力，重组的CALB在pH7.5～9.5之间的溶液中比较稳定，发现Zn2+对CALB有强烈的抑制作用;Mg2+、Ni+和Co2+对酶活几乎没有影响;非离子表明活性剂Triton X-100可提高CALB的活性，而阴离子表面活性剂SDS对CALB的活性略有抑制作用.此结果与孙金鹏等［13］的研究结果差异较大，分析是和酶活测定方法不同有关，也可能和CALB基因来源的菌株不同有关.后续研究会利用大孔树脂等材料对CALB进行固定化研究，有望进一步降低CALB的使用成本.

［1］粟慧君，马骏，蔡莉，等.合成有机载体固定化猪胰脂肪酶性质研究［J］.四川师范大学学报:自然科学版，2008，31(5):586-589.

［2］Uppenberg J，Hansen M T，Patkar S，et al.The sequence，crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica［J］.Structure，1994，2:293-308.

［3］Kirk O，Christensen M W.Lipases from Candida antarctica:unique biocatalysts from a unique origin［J］.Organic Process Research ＆ Development，2002，6(4):446-451.

［4］Senanayake S P J N，Shahidi F.Incorporation of docosahexaenoic acid(DHA)into evening primrose(Oenothera biennis L)oil via lipase-catalyzed transesterification［J］.Food Chemistry，2004，85(4):489-496.

［5］Sivalingam G，Chattopadhyay S，Madras G.Enzymatic degradation of poly(ε -caprolactone)，poly(vinylacetate)and their blends by lipases［J］.Chemical Engineering Science，2003，58(13):2911-2919.

［6］Rodriguez J M，Roura E，Contreras E.Biosynthesis of ethylbutyrate using immobilized lipase:a statistical approach［J］.Process Biochemistry，2005，40(1):63-68.

［7］Monteiro C M，Lourenco N M，Afonsoo C A.Separation of secondary alcohols via enzymatic kinetic resolution using fatty esters as reusable acylating agents［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2010，21:952-956.

［8］De Gonzalo G，Brieva R，Sánchez V M，et al.Enzymatic resolution of trans-4-(4'-fluorophenyl)-3-hydroxymethylpiperidines，key intermediates in the synthesis of(-)-paroxetine［J］.J Organic Chem，2001，66(26):8947-8953.

［9］Barbosa O，Ortiz C，Torres R，et al.Effect of the immobilization protocol on the properties of lipase B from Candida Antarctica in organic media:Enantiospecific production of atenolol acetate［J］.J Mol Catalysis B:Enzymatic，2011，71(3/4):124-132.

［10］Jun C，BW J，Joo J C，et al.Thermostabilization of Candida antarctica lipase B by double immobilization:Adsorption on a macroporous polyacrylate carrier and R1silaffin-mediated biosilicification［J］.Proc Biochem，2013，48(8):1181-1187.

［11］Hoegh I，Patkar S，Halkier T，et al.Two lipases from Candida antarctica:cloning and expression in Aspergillus oryzae［J］.Canadian J Botany，1995，73(S1):869-875.

［12］Liu D，Schmid R D，Rusnak M.Functional expression of Candida antarctica lipase B in the Escherichia coli cytoplasm-a screening system for a frequently used biocatalyst［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72:1024-1032.

［13］孙金鹏，钱圣一，敬科举，等.南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究［J］.厦门大学学报:自然科学版，2011，50(4):765-771.

［14］Han S Y，Pan Z Y，Huang D F，et al.Highly efficient synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by CALB-displaying Saccharomyces cerevisiae whole-cells in non-aqueous phase［J］.J Molecular Catalysis B:Enzymatic，2009，59(1/3):168-172.

［15］ Kato M，Fuchimoto J，Tanino T，et al.Preparation of a whole-cell biocatalyst of mutated Candida antarctica lipase B(mCALB)by a yeast molecular display system and its practical properties［J］.Appl Microbiology Biotechnology，2007，75(3):549-555.

［16］Sue M P，Mariana L F，Brian M N，et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system［J］.Yeast，2005，22:249-270.

［17］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-Dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

［18］李燕妮，衣婷婷，李龙森.南极假丝酵母脂肪酶在15 L发酵罐中培养条件的研究［J］.化学与生物工程，2007，24(7):43-48.