葡萄糖氧化酶对饲喂含霉变饲料小鼠体重和肠道微生物的影响

赵艳姣 崔亚利* 陈宝江 孙海云 李三吓 李同洲

(1.河北农业大学动物医学院，保定 071001;2.河北农业大学动物科技学院，保定 071001)

玉米是畜禽能量饲料的主要原料，在畜禽饲料中占有较高比例。玉米保管不当很容易发霉，产生黄曲霉毒素(AF)、赤霉烯酮及呕吐霉素(DON)等［1］，危害动物的生长、生产和繁殖，并具有剂量和时间依赖关系。唐雨蕊［2］通过给小鼠灌服250μg/kg体重的AFB1进行攻毒处理，发现AFB1攻毒组小鼠肠道中的乳酸菌数量均下降，而肠杆菌总数均上升，表明肠道菌群的正常生态环境已遭到破坏，灌服乳杆菌组的双歧杆菌数量显著上升，肠杆菌数量则恢复为正常值，与对照组差异不显著，提示AFB1可通过损伤肝脏功能，影响肠肝循环系统而破坏盲肠的微生态平衡，而灌服乳杆菌则可改善此影响。宋海彬等［3］通过对葡萄糖氧化酶的研究称葡萄糖氧化酶系统名称为β－D－葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)，饲料中添加一定量的GOD，可以抑制蛋鸡盲肠内大肠杆菌的增殖，GOD在催化反应过程中生成的H2O2同时消耗大量的氧气，H2O2可以抑制霉菌的生长和增殖，降低霉菌毒素的含量，同时低氧的环境对乳酸菌的生长和繁殖有促进作用。GOD在催化肠道内的葡萄糖发生反应的过程中其反应产物葡萄糖酸还可以降低胃肠内pH，为乳酸杆菌的生长创造了酸性环境，乳酸杆菌的大量生长又有利于饲料的消化，对小鼠的平均日增重(ADG)有显著提高的效果。同时，反应生成的H2O2还具有灭菌的作用，当H2O2积累到一定的浓度时，可直接抑制大肠杆菌等有害菌的生长繁殖［4］。赵国先等［5］研究表明GOD能显著降低肉鸡空肠、回肠pH，具有明显抑制大肠杆菌生长、促进盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌增殖的作用。但有研究认为GOD可显著提高断奶仔猪、断奶仔兔的ADG和饲料转化率，但不影响仔兔免疫器官的发育［6－7］。

GOD发挥作用的机理之一是能够解除肠道霉菌毒素中毒及药物中毒。饲料霉变是困扰饲料业和畜牧业的一个全球性难题，如何有效去除和降低霉菌毒素污染对动物的危害已成为人们研究的重点。目前，关于GOD的研究多集中在对畜禽生产性能、肠道微生物和血清生化指标的影响方面，对GOD缓解霉变饲料所引起慢性中毒的研究较少。本试验通过在昆明小鼠饲料中添加不同浓度霉变玉米面，旨在研究GOD制剂对ADG、肠道菌群变化的影响，为GOD制剂应用于缓解霉变玉米所致畜禽中毒提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和饲料

从北京大学医学部购入雄性清洁级昆明鼠130只，体重18～22 g，4周龄左右［试验动物生产许可证号:SCXK(京)2011－0012］。从北京科澳协力饲料有限公司购入小鼠粉状维持料和颗粒料。

1.2 霉变玉米面的制作和检测

1.2.1 霉变玉米面制备

恒温培养箱温度设定为(29±1)℃，湿度80%～85%，以利于霉菌的生长。内有蒸馏水的搪瓷盘置于培养箱内以保持湿度。将盛有玉米面的灭菌搪瓷盘置于培养箱内，每日观察温湿度和玉米面的发霉程度。

1.2.2 霉菌培养

取霉变8 d的玉米，采用高盐察氏培养基进行培养。经中国农业科学院测定AFB1含量为225.9 μg/kg，DON 含量为 1 023.10 μg/kg。

1.2.3 小鼠颗粒饲料的制作

根据试验设计，在小鼠粉状维持料中加入相应比例的GOD制剂和霉变玉米，加水搅拌。水与料的比例大概为1∶2，待混合料能握成团但稍微一握还能松散时比较适宜。使用塑料漏斗制成柱状颗粒料，50℃ 5～6 h烘干。

1.3 GOD 制剂

GOD制剂为保定鲜尔康生物工程有限责任公司生产，酶活力为150 000 U，麸皮作为载体。

1.4 试验设计和饲养管理

小鼠常规饲养7 d后开始试验，试验期为40和60 d。小鼠随机分为13组，试验分组及处理见表1。10%霉变玉米面组饲料中AFB1含量为22.59 μg/kg，DON 含量为 102.31 μg/kg。20%霉变玉米面组饲料中 AFB1含量为 45.18μg/kg，DON含量为204.62μg/kg。30%霉变玉米面组饲料中 AFB1含量为 67.77 μg/kg，DON 含量为306.93 μg/kg。饲养在温度为(25±3)℃，相对湿度为55%，自然光照的环境中。

表1 试验分组及处理Table 1 Experiment grouping and treatment

1.5 测定指标和方法

1.5.1 体重测定

分别在饲喂发霉饲料的第1天、第20天、第40天、第60天时称重。

1.5.2 样品采集

在试验的第40天和第60天，各组随机选取5只小鼠，禁食12 h后，称重，颈椎脱臼法处死，刮取肠道(空肠、回肠和结肠)混合物食糜置于1.5 mL离心管中，－20℃冰冻保存。

1.5.3 肠道微生物检测

从－20 ℃中取出食糜，快速称取 0.2～0.3 g 放入试管内，灭菌生理盐水10倍稀释，涡旋混合仪混合1～2 min，逐级稀释，取预期梯度及左右各2个梯度的稀释液0.1 mL，在培养基上涂布接种，每个梯度设2个重复，选取菌落数在5～100个的平皿进行计数。大肠杆菌采用麦康凯琼脂，空气中37℃培养18 h。乳酸杆菌用乳酸杆菌选择性琼脂，厌氧环境37℃培养24 h，观察计数。所用培养基均购于青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.6 数据处理与分析

采用SPSS 16.0的单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用LSD法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 GOD对小鼠ADG的影响

由表2可知，饲喂20 d时，添加3种不同浓度的GOD，对10%和30%霉变玉米面组小鼠ADG的影响不显著(P＞0.05)。20%霉变玉米面饲料，添加0.1%和0.3%GOD组ADG显著大于试验对照组(P＜0.05)。

表2 GOD对小鼠ADG的影响Table 2 Effects of GOD on average daily gain of mice g

饲喂40 d时，10%霉变玉米面饲料，添加GOD各组差异不显著(P＜0.05)。20%霉变玉米面饲料，添加0.1%和0.3%GOD组 ADG极显著高于试验对照组(P＜0.01)。30%霉变玉米面饲料，添加0.3%GOD组与其他各组比较ADG极显著提高(P＜0.01)。

饲喂60 d时，10%霉变玉米面饲料，试验对照组ADG与空白对照组比较极显著降低(P＜0.01)，添加 0.3%和 0.5%GOD 组与试验对照组比较ADG显著增加(P＜0.05)，添加 GOD 3组之间差异不显著(P＞0.05)。20%霉变玉米面饲料，试验对照组与空白对照组比较极显著降低(P＜0.01)，添加 0.3%GOD 组与试验对照组、0.1%GOD组和0.5%GOD组比较，ADG极显著增加(P＜0.01)。30%霉变玉米面饲料，试验对照组与空白对照组比较极显著降低(P＜0.01)，添加 0.3%GOD组与试验对照组和0.1%GOD组比较ADG极显著增加(P＜0.01)。

2.2 GOD对小鼠肠道微生物菌群的影响

2.2.1 GOD 对小鼠大肠杆菌的影响

由表3可知，小鼠饲料中添加霉变玉米面的试验对照组，肠道内大肠杆菌数量与空白对照组比较极显著增加(P＜0.01)。添加10%霉变玉米面，3种不同浓度的GOD组与试验对照组比较都极显著降低了大肠杆菌数量(P＜0.01)。添加0.3%的GOD，饲喂60 d时大肠杆菌数量与饲喂40 d时比较极显著降低(P＜0.01)。添加20%霉变玉米面，3种不同浓度的GOD组与试验对照组比较也都极显著降低了大肠杆菌数量(P＜0.01)。0.3%和0.5%的GOD添加量抑菌效果较好。添加30%霉变玉米面，除饲喂40 d时0.1%GOD组与试验对照组差异不显著(P＞0.05)外，GOD显著或极显著减少了肠道大肠杆菌的数量(P＜0.05或P＜0.01)，0.3%GOD 添加效果较好。

表3 GOD对小鼠肠道微生物的影响Table 3 Effects of GOD on intestinal microflora of mice lg(CFU/g)

2.2.2 GOD 对小鼠乳酸杆菌的影响

由表3可知，小鼠饲料中添加20%或30%霉变玉米面的试验对照组，肠道内乳酸杆菌数量与空白对照组比较极显著降低(P＜0.01)。添加10%霉变玉米面，0.3%和 0.5%GOD 组与试验对照组比较都极显著增加了乳酸杆菌数量(P＜0.01)，2 组之间差异不显著(P＞0.05)。饲喂 60 d时0.1%GOD组与试验对照组比较显著增加了乳酸杆菌的数量(P＜0.05)。添加20%霉变玉米面，饲喂40 d时，与试验对照组比较，0.3%GOD显著提高了乳酸杆菌的数量(P＜0.05)。60 d时，3种不同浓度的GOD组与试验对照组比较都极显著提高了乳酸杆菌数量(P＜0.01)。添加30%霉变玉米面，饲喂60 d时，与试验对照组比较，0.1%、0.3%和0.5%的GOD添加量极显著提高了肠道乳酸杆菌数量(P＜0.01)。

3 讨论

3.1 GOD对小鼠ADG的影响

GOD在催化反应过程中生成H2O2同时消耗大量的氧气，H2O2可以抑制霉菌，降低霉菌毒素的含量，同时低氧的环境可减少饲料营养的损失［3］。研究表明，GOD可提高断奶仔猪、断奶仔兔的日增重和饲料转化率，不影响仔兔免疫器官的发育［6－7］。Yunus 等［8］研究表明霉变饲料能造成动物多方面的危害已成为共识，不同动物对AFB1的敏感性也不同，兔子的敏感性最强，依次为幼鸭、猪、狗、豚鼠、绵羊、小鼠、鸡和大鼠。张磊［9］提出雏鸡饲喂含黄曲霉毒素不是很高的霉玉米，临床上虽无典型中毒表现，但是会使机体免疫机能下降，生长发育受阻，体重增长显著减慢且参差不齐，饲料报酬率降低。王凯等［10］提出45日龄昆明小鼠饲喂自制霉变玉米饼4周后，小鼠体重都有不同程度的下降，而且影响小鼠的免疫功能，造成T、B淋巴细胞计数的改变。本试验测定结果显示，添加20%或30%霉变玉米面组，饲喂20、40和60 d后，0.3%的GOD对提高小鼠ADG效果较好，能显著改善由于霉变玉米对ADG造成的不良效果，说明GOD能够有效改善霉菌中毒对小鼠消化系统产生的直接毒害作用，促进营养物质吸收。

3.2 GOD对小鼠肠道微生物的影响

李焰［11］研究表明在父母代蛋种鸡育成料中添加GOD对由大肠杆菌等引起的肠道腹泻有明显的预防作用，对大肠杆菌病有明显的预防及治疗作用。杨久仙等［6］研究表明饲料中添加GOD可降低仔猪胃肠道内大肠杆菌数量，增加乳酸杆菌的数量。由于GOD可催化葡萄糖酸的形成，所以可提供胃肠道的酸性环境。诸多研究表明，酸性条件可以抑制大肠杆菌等有害菌的生长繁殖，而有利于乳酸菌的生长繁殖。Franco等［12］认为添加磷酸型酸化剂A和乳酸型酸化剂B对体外培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都有明显抑制作用，不同比例的富马酸和乳酸使肠道大肠杆菌数明显减少。本试验结果显示，饲喂添加不同比例的霉变饲料后，GOD能显著减少肠道内大肠杆菌的数量，大肠杆菌的数量与GOD的添加量没有明显的剂量依赖关系;添加0.3%GOD提高乳酸菌数量的效果较好，而且随着饲喂时间的延长，效果更好。GOD可能通过降低小鼠肠道内大肠杆菌的数量，提高肠道乳酸杆菌的数量，从而提高饲料的转化率和吸收率，促进小鼠的生长。

4 结论

GOD能够降低小鼠肠道内大肠杆菌的数量，提高乳酸杆菌的数量，使小鼠ADG增加。饲料中AFB1含量低于 67.77 μg/kg时，添加 0.3%的GOD效果较好。这说明GOD能够缓解霉变饲料对小鼠生长造成的影响。

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