日本木瓜和皱皮木瓜过氧化物酶的酶学性质比较*

宋双双，刘峰，刘伟，王晓，Dan Staerk，李圣波，崔莉

1(山东省分析测试中心，山东 济南，250014)2(山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安，271018)

3(山东亚特生态技术有限公司，山东临沂，276017)

日本木瓜［Chaenomeles japonica(Thunb.)Lindl］是蔷薇科(Rosaceae)木瓜属植物，又名倭海棠，原产于日本，中国江苏、浙江、台湾、陕西庭院习见栽培［1-2］，其果实为药材的习用品［3］，具有化湿和胃，舒筋活络的功效［4］。皱皮木瓜又名汤木瓜、宣木瓜等，是蔷薇科贴梗海棠［Chaenomeles spiciosa(Sweet)Nakai］的近成熟果实，主要产于安徽、浙江、湖北、四川等地［5］，功效同日本木瓜［6］。目前对于日本木瓜的研究较少，仅有化学成分的研究［3］，关于其果实内的氧化、抗氧化酶类的相关研究鲜见报道。皱皮木瓜中抗氧化酶类的相关报道主要有SOD的分离纯化［7］，氧化酶类有多酚氧化酶(PPO)的性质研究［8］等。对于木瓜中的过氧化物酶(POD)，仅见番木瓜中POD的纯化及性质研究［9］，关于日本木瓜和皱皮木瓜中POD的酶学特性的研究均未见报道。

POD广泛存在于动植物和微生物体内，是一种以血红素为辅基的氧化酶［10］，可催化由过氧化氢参与氧化各种还原剂［11］的反应，是果实成熟和衰老的生理指标，参与果实酶促褐变，对果实的色泽及成分含量等造成不良影响。目前，对果蔬POD的纯化及酶学性质研究较广泛，但是对于大部分原料，其不同品种间的POD酶学性质的比较研究还较少。本文通过比较日本木瓜和皱皮木瓜中POD的酶学性质，为进一步深入研究两者POD的结构差异，为提高木瓜加工产品的品质等提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 材料

木瓜果实由山东亚特生态技术有限公司提供，选择大小均一、完整无机械伤、无病虫害的果实，-20℃贮藏。编号A为YATS 115(皱皮木瓜)，编号B为西府海棠(日本木瓜)。

1.2 试剂

Tris、愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、柠檬酸钠、Na2HPO4、NaH2PO4、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、Na2SO3、DTT、曲酸、谷胱甘肽(还原型)、吐温 -80、SDS、偏重亚硫酸钠、EDTA-2Na、环庚三烯酚酮(tropolone)，所用试剂均为分析纯。

1.3 仪器

GENESYS 10S UV-VIS紫外可见分光光度计，Thermo;HH-S2数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂;Thermo Multifuge X1R离心机，Thermo;人工气候箱，宁波莱福科技有限公司;BAS124S万分之一天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

2 实验方法

2.1 POD粗酶液的提取

A、B 各取 10 g，以 1∶1.5(g∶mL)料液比加入Tris-Hcl缓冲液(20 mmol/L，pH 7.5)，加 0.1%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮和0.3%(v/v)Triton X-100，低温下研磨，研磨液4℃于10 000 r/min离心20 min，上清液即为所需粗酶液，于4℃冰箱中保存备用。

2.2 POD活性的测定

测定溶液体系为3 mL，20 mmol/L Tris-HCl缓冲液pH 7.5，其中2.95 mL底物含有10 mmol/L愈创木酚和10 mmol/L H2O2，0.05 mL酶液。于25℃反应20 min，在470 nm处测定吸光度变化值。以每分钟每毫升反应体系OD值改变0.01为1个酶活力单位(U)［12］。

2.3 POD酶学性质的测定

2.3.1 最适温度和温度稳定性

将反应底物分别置于 4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃ 的水浴锅中保温 5 min，加入木瓜的粗酶液，测定吸光度。以最适温度的酶活性为100%，其余温度下测定的酶活性与之的比值即为相对酶活性［13］。

不同品种木瓜的粗酶液分别保存于10、20、30、40℃ 条件下，待 20、40、60 min取出并测定酶活性［14］。以每个温度下的初始酶活性为100%，不同时间测定的酶活性与之相比即为相对酶活性。

2.3.2 最适pH值和pH值稳定性

测定不同品种木瓜的粗酶液在不同pH值(3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9)的缓冲液中的酶活性［15］。以最适条件下的酶活性为100%，其余pH值条件下测定的酶活性与之的比值即为相对酶活性。

将木瓜的粗酶液分别在不同pH值的缓冲液(3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9)中 4 ℃ 保存6 h，测定酶活性。以最适条件下的酶活性为100%。

2.3.3 金属离子的影响

分别配制终浓度为含有1、5、10 mmol/L金属离子的底物溶液，加入POD酶液，测定酶活力，以不含金属离子时的酶活力为100%，分析不同的金属离子对POD酶活性的影响。

2.3.4 POD米氏常数的测定

在25℃的条件下，分别改变底物愈创木酚和H2O2的浓度，考察底物浓度对木瓜POD催化速度的影响，采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk 法)［16］，分别求出木瓜POD对于愈创木酚和H2O2的米氏常数Km值。

2.3.5 抑制剂和表面活性剂的影响

将各种抑制剂及表面活性剂与底物混合成终浓度分别为1、5、10 mmol/L的溶液，加入酶液，测定吸光度变化。以不含抑制剂及表面活性剂时的酶活性为100%。

2.4 数据分析

采用DPS软件和Excel 2003对实验数据进行统计学分析。

3 结果与分析

3.1 POD最适温度

POD活性受温度的影响很大，在最适温度范围内，POD活性可以达到最大。由图1可以看出，温度对品种A、B的影响呈现完全不同的趋势。当反应温度低于30℃时，B的酶活性随着温度的升高而增大;超过30℃时，随着温度的升高酶活性下降直至失活。当反应温度超过20℃，品种A的酶活性随着温度的升高而下降。

图1 不同品种木瓜POD的最适温度Fig.1 The optimum temperature of Chaenomeles peroxidase

3.2 POD的温度稳定性

POD在一定的温度范围内可以长时间地保持活性。由图2可知，日本木瓜和皱皮木瓜在30℃以内都能较好地保持活性。不同来源的POD耐热性不同，水果和蔬菜中的 POD是一种较耐热的酶类［17-18］。Ekrem和HU在各自的文章中提到甘瓠和莴苣茎中的POD的热耐受性都很好，能在60℃保持一定的活性［14，19］，刘金磊和赵岩分别对苦瓜和洋葱的POD进行了研究，发现两者的POD也都对温度具有较高的稳定性及耐受性［20，21］，但本文中的 2 种木瓜的POD对温度的耐受性比较弱，与目前报道的大多数POD的热稳定性不同，其中，日本木瓜对热的耐受性强于皱皮木瓜，日本木瓜B在50℃条件下保存20 min会失活，这与菜花中POD的热稳定性相似［17］。

图2 不同品种木瓜POD的温度稳定性Fig.2 Temperature stability of Chaenomeles peroxidase

3.3 最适pH值

从图3中可以看出，2个品种的POD活性均随着pH值的增加呈现先增加后降低的趋势，两者都具有两个最适pH值，其中，日本木瓜B的两个最适pH值差别不是很明显，在pH值为5～6时，都具有较高的活性。

图3 不同品种木瓜POD的最适pH值Fig.3 The optimum pH of Chaenomeles peroxidase

3.4 pH值稳定性

由图4可以看出，皱皮木瓜和日本木瓜中POD的pH值稳定性差别很大，其随pH值变化的趋势也不同。A的POD在pH值5.5～8.5时稳定性较好，一直能保持80%以上的活性，在酸性条件下保存相对不稳定。而日本木瓜B的POD在酸性条件下比较稳定，在4～5.5活性迅速从85%以上降低至50%。

图4 不同品种木瓜POD的pH值稳定性Fig.4 pH stability of Chaenomeles peroxidase

3.5 金属离子的影响

金属离子可以在一定程度上影响POD的活性，表1所示的金属离子中，只有Ca2+可促进POD活性，其余的金属离子都对POD的活性起不同程度的抑制作用。其中，Ca2+对皱皮木瓜A中POD的活性的促进作用显著高于B，而Yihong Hu在对莴苣茎中POD的酶学性质研究中提到Ca2+对POD起抑制作用，可以抑制60%左右的酶活性［14］，可见不同来源的POD可能结构存在较大差异，导致金属离子对其有完全相反的作用。Zn2+在低浓度时对A和B的抑制作用相同，在10mmol/L时，对 A、B的作用相反，Mn2+的抑制作用比较明显，10 mmol/L Mn2+抑制 A、B几乎50%的POD酶活，Mn2+对A中POD的抑制能力随着浓度的增大而增强，但对B中POD的抑制能力与浓度并不存在线性相关性。其他3种金属离子对A和B的抑制效果没有显著差异。

表1 不同金属离子对POD活性的影响Table 1 Influence of metalions on Chaenomeles peroxidase activity

续表1

3.6 米氏常数的测定

分别以1/［S］为横坐标，1/V为纵坐标，采用双倒数作图法，得线性方程，如图6所示，2种木瓜中POD催化愈创木酚和H2O2的酶促褐变反应均符合米氏方程，进而求得2种木瓜的POD的Km值。Km值的大小可近似地表示酶与底物的亲和力，Km值越大表示酶与底物的亲和力越小，反之，则表示亲和力越大［16］。可见，皱皮木瓜A中的POD与愈创木酚的结合能力强于日本木瓜。

图5

3.7 抑制剂和表面活性剂的影响

抑制剂和表面活性剂具有还原性，可以抑制POD催化氧化愈创木酚。不同的化合物或不同浓度的同种化合物对不同品种木瓜POD活性的影响差别很大。如表2所示，1 mmol/L的抗坏血酸、柠檬酸、谷胱甘肽(还原型)、Na2S2O5及高浓度的EDTA-2Na对品种B的POD活性都起促进作用，实验中的所有化合物均对A的POD活性有抑制作用，且抑制能力随着浓度的增大而增强，其中，柠檬酸、吐温-80对A的抑制作用显著强于B。

图6 POD酶促反应双倒数作图Fig.6 Lineweaver-Burk plot of Chaenomeles peroxidase

SDS对2种木瓜中POD活性的抑制作用最强，在低浓度(1 mmol/L)时即可完全抑制POD活性，多项有关酶活动力学的研究［22-23］均表明SDS对辣根、葡萄等多种来源的POD活性有很强的促进失活作用，本研究在木瓜中也得到同样的结果，SDS是一种变性剂，能够破坏蛋白质分子中的疏水键和氢键，进而改变酶的空间构象，导致酶活性降低［12］，可见表面活性剂SDS是过氧化物酶类重要的钝化剂。由表2可以看出，大部分抑制剂和表面活性剂对品种B的POD的抑制能力都弱于品种A，可见抑制剂和表面活性剂对日本木瓜的抑制能力低于皱皮木瓜。

表2 抑制剂和表面活性剂对POD活性的影响Table 2 Influence of inhibition dose and surfactant on peroxidase activity

续表2

4 结论与讨论

皱皮木瓜和日本木瓜的POD的最适温度分别为15℃、30℃，二者都在30℃以内能较好地保持活性。两种POD都有两个最适pH值，日本木瓜的两个最适pH值差别不明显;皱皮木瓜的POD的pH值稳定性范围为5.5～8.5，日本木瓜的POD在酸性条件下比较稳定。金属离子对B两种木瓜的影响基本相同，Ca2+对两种POD活性都有促进作用，对两种POD抑制能力最强的化合物是SDS，其次为抗坏血酸。

日本木瓜和皱皮木瓜的POD都含有两个最适pH值，可能与POD酶的空间构象有关，或者可能存在两种同工酶，具体原因有待于日后深入研究。本研究中两种木瓜的POD对温度的耐受性都比较弱，仅在30℃以内能较好的保持活性，因此，这两个品种的木瓜的POD要在低温下保存，这两种木瓜POD的热稳定性比目前报道的大多数果蔬中POD差，可能是因为原料来源造成的，目前使用等电聚焦技术研究已证明不同POD同功酶的耐热性存在差异［17］，含有不同的同工酶也可能是一个原因，有待进一步研究验证。Ca2+对两个POD活性都起促进作用，在加工生产中应避免木瓜产品与Ca2+接触。抑制剂和表面活性剂对两个品种的POD的作用规律基本相同，还原性强的化合物对POD都有很强的抑制作用，其他表面活性剂对POD的活性也有很强的抑制作用，可以应用于加工生产过程中。

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