基于3D水凝胶微孔阵列芯片的肺癌细胞检测

霍丹群郭明遗邓艳杨眉法焕宝侯长军（重庆大学生物工程学院；化学工程学院,重庆400044）

基于3D水凝胶微孔阵列芯片的肺癌细胞检测

霍丹群1郭明遗1邓艳1杨眉1法焕宝2侯长军*1
（重庆大学生物工程学院1；化学工程学院2,重庆400044）

基于聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）的紫外光聚合性能,引入甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）增加亲水性,引入N-乙烯吡咯烷酮（NVP）加强材料的压缩屈服应变力,在各功能单体体积比PEGDA∶HEMA∶NVP为5∶4∶1时,设计构建了一种模拟肺癌组织生理微环境的无毒、低免疫原性、高亲水性的三维水凝胶微孔阵列芯片（60 mm×20 mm×3 mm）。通过红外表征及溶胀率测试,证明此芯片可适用于肺癌细胞的培养检测且稳定性好。集成16种特异性染料组成的卟啉可视传感系统,实时在线检测和分析肺癌细胞代谢物指纹图谱。提取检测差谱图色度值数据,基于平方欧氏距离,主成分分析（PCA）结果表明,此芯片能对正常肺细胞和肺癌细胞代谢液正确区分；聚类分析（HCA）结果表明,能对30种肺细胞代谢液样品正确归类。本研究开发的基于微孔阵列的肺癌细胞培养代谢液检测平台为医学研究提供了一种全新的可行性检测方法。

微流控芯片；肺癌；代谢液检测；可视化传感阵列

1 引 言

肺癌是威胁人类健康的重大疾病之一,发病率逐年增加,低龄化趋势明显,预计10年后,我国肺癌患者将超过100万人次[1]。传统的肺癌检测方法涉及胸部X线、CT成像及核磁共振成像等,设备复杂,操作专业技术要求高,仪器价格昂贵,故迫切需要行之有效且价廉普适的检测方法[1]。

微流控芯片技术（Microfluidics chip）又称芯片实验室（Lab-on-a-chip）,具有自动化、高度集成化、检测成本低、便携、试剂消耗少、所需样本少等特点[3～5]。目前,微流控芯片系统在高通量筛选[6,7]、药物研发[8]、免疫检测[9]、食品安全[10]、环境监测[11]、疾病诊断和治疗[12,13]、取证测试[14]、再生医学[15,16]等领域都得到了广泛应用,但用于细胞捕获、培养、代谢物实时检测的微流控芯片尚鲜有报道。具有优良生物相容性的甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）和聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）构成的水凝胶微流控芯片是优良的细胞培养支架材料[14,17,18],具有无毒[19]、免疫原性低[15]、可操控性强[20]、高亲水性[21],且可进行表面改性修饰[22,23]的特点；更重要的是由聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）交联形成的3D亲水网络结构在模拟人体内组织微环境和可控体外培养上皆远优于传统的2D培养模式。

基于此,本研究设计了一种模拟肺部组织分流结构且可重复使用的低成本、成型快、便携式、加工工艺简单的3D微孔阵列芯片[24]。利用PEGDA的紫外光聚合性能、HEMA的高亲水性,引入N-乙烯吡咯烷酮（NVP）加强材料的压缩应变力[25],改善PEGDA水凝胶材料的刚性[26],构建了一种集肺癌细胞的分离、捕获、培养、观察、检测等功能性微单元于一体的水凝胶微流控芯片,可对细胞附着、生长、真实形态表达起促进作用。集成卟啉可视传感系统可实时在线检测和分析肺癌细胞代谢物特征,从而获得肺癌细胞相关的生物应答和代谢等生理信息。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

NICOLET 6700傅立叶变换红外光谱仪、1300系列A2超净工作台（美国Thermo Fisher公司）；便携式紫外线UV固化灯（365 nm,100W,上海迈芯光电科技有限公司）；DMI3000B倒置生物显微镜（德国Leica公司）；Forma 370系列CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；LDZX-75KBS高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）。高纯氮气（纯度≥99.99％,重庆海格气体公司）。

聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA,平均分子量575,Sigma-Aldrich公司）；甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）、N-乙烯基吡咯酮（NVP）（Aladdin公司）；PDMS预聚体及固化剂（美国Dow Corning公司）；光引发剂Irgacure2959（上海长哲生物有限公司）；肺癌细胞与正常肺细胞（中国人民解放军第三军医大学西南医院）；1640细胞培养液、胎牛血清、胰酶、青霉素和链霉素均购自Gibco公司。

2.2 芯片设计及制作

2.2.1 微孔阵列芯片设计利用CorelDRAW软件设计芯片掩膜结构（图1）,尺寸60 mm×20 mm,打印高精度掩膜用于后续紫外聚合反应。细胞培养层（a）设计有直径为0.9 mm的60个细胞培养室阵列和代谢液收集池（12 mm×16 mm）；微通道层（b）模拟人体肺部结构,进口支管内径2 mm,分支支管内径为4 mm,流体微通道内径为0.6 mm,且在（a）层对应结构处同样设有60个细胞室和代谢液收集池,形成十字交叉微孔结构；培养封盖层（c）层设计有检测窗口,内径为0.8 mm的培养基出入口。三层结构可精确对接。

图1 芯片掩膜设计图,第一层的微孔阵列为细胞培养层（a）,第二层结构为微通道层（b）,第三层为气密性结构封盖层（c）Fig.1 Structure of the designed hydrogelmicrofluidic chip mask.1stmicropore layer for cell culture（a）, 2ndhydrogel layer asmicrochannels（b）and 3rdairtight cover（c）

2.2.2 微孔阵列芯片加工过程按PEGDA∶HEMA∶NVP为5∶4∶1（V/V）加入各单体材料形成预聚物,避光加入预聚物总质量0.3％的光引发剂,混合均匀,注入以第一层掩膜密封的模具中,室温下,用100 W紫外灯照射10min光聚合,脱模得到一层结构。整个反应过程在氮气保护下进行。采用相同方法制得第二层芯片结构,图2为芯片实物图,模拟肺部组织分流特点及外型构成,成功制作出可用于肺癌细胞代谢物检测的微孔阵列芯片,进样分流支管及代谢液收集槽清晰可见,芯片微通道结构整齐陈列于芯片上。再以聚二甲基硅氧烷（PDMS）键合芯片,形成一个环境可控且可进行标准化培养的微流控芯片。

图2 水凝胶微孔阵列芯片的实物图Fig.2 Hydrogelmicro-well array chip（60 mm×20 mm）

2.3 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）表征

傅立叶变换红外光谱测定波数范围为400～4000 cm-1,其中微流控水凝胶芯片压成粉末采用KBr压片法测定,液体PEGDA单体、HEMA单体、NVP单体采用液膜法测定。

2.4 芯片溶胀率测试

分别取制作好的水凝胶微流控芯片,称量其干重Wd,设置不同梯度的温度及pH值,将芯片置于PBS磷酸盐缓冲液中溶胀24 h至溶胀平衡,称重得湿重Ww,材料的溶胀率Swelling ratio（SR）, SR（％）=（Ww-Wd）/Wd,每组做5次平行测定。

2.5 细胞培养及代谢液检测

2.5.1 细胞培养在超净工作台中,先将芯片依次置于75％乙醇中2 h、灭菌的PBS缓冲液中1 h,使芯片灭菌。使用微量注射器将细胞悬液（2×105个/mL）从芯片的入口缓慢匀速注入,于收集槽处收集多余的悬液,移入CO2培养箱孵育1 h,待微孔阵列中捕获到足够的肺癌细胞,吸取新鲜培养基从入口缓慢冲洗,将微通道内的残留细胞和未被微孔捕获的细胞冲至收集槽吸出芯片。移入孵箱进行培养,观察,每隔8h记录细胞形状。培养36 h后细胞代谢液进行可视化传感芯片的检测。

2.5.2 检测传感芯片制作筛选出16种利用溶胶凝胶法制备的特异性卟啉和酸碱指示剂染料作为传感阵列点,在点样室中,用玻璃点样毛细管取样,点到裁剪好的12 mm×12 mm的PVDF（4×4）膜上,制备完成的芯片通氮气干燥20min,密封避光保存以备后续检测使用。

2.5.3 指纹图谱的提取与分析应用所设计的传感芯片,检测细胞代谢液,选取检测前和检测后的差谱图,提取特征RGB颜色标准值,计算欧氏距离,并进行主成分和系列聚类数据分析。

3 结果与讨论

3.1 芯片共聚物水凝胶的红外光谱分析

在芯片样本（Chip）以及3种单体（PEGDA、HEMA、NVP）的FT-IR图谱（图3）中,可见共聚物芯片集合了 PEGDA、HEMA、NVP的FT-IR特征结构。3422.47 cm-1为末端-OH的伸缩振动峰,2980～2876.17 cm-1区域为CH3,CH2,CH中CH的伸缩振动峰,1731.55 cm-1为酯键 CO振动峰,1452.46 cm-1处为CH2和CH3的弯曲振动,1101.86 cm-1处为COOR酯键的伸缩振动峰,752.44 cm-1处为CH2的平面摇摆振动峰和OH 面外弯曲振动峰,且 2900 cm-1附近的CH上氢键所对应的特征吸收峰消失及1637 cm-1附近的双键吸收峰大幅度减弱,说明双键已被打开,各材料单体之间发生了共聚反应,形成了具备研究设计所需材料特征的水凝胶芯片。

图3 3种单体（甲基丙烯酸羟乙酯HEMA,聚乙二醇双丙烯酸酯PEGDA,N-乙烯吡咯烷酮NVP）及芯片共聚物水凝胶的FT-IR谱Fig.3 FT-IR spectra of three monomer（2-hydroxyethyl methacrylate（HEMA）,Poly（ethylene glycol）diacrylate （PEGDA）,1-vinyl-2-pyrrolidone（NVP））and copolymer hydrogel

3.2 温度及pH值对微流控芯片溶胀率的影响

图4所示为水凝胶微流控芯片在不同温度梯度及pH值下溶胀率的变化,随着温度和pH值升高,溶胀率皆呈现降低趋势,但变化幅度小,表明此芯片可在正常的室温和37℃生理温度以及生理pH范围内使用,且结构稳定性好,避免了芯片结构和性能的不稳定对后续实验的影响。

3.3 微孔阵列芯片制备

利用PEGDA材料的紫外聚合功能,辅以高精度的掩膜,制作出了水凝胶微孔阵列芯片。图5为显微镜下微流控芯片的部分结构示意图,图5a为十字交叉微孔结构,图5b为芯片弯道结构。尺寸未发生偏差,且边缘整齐,结构清晰,表面平整,加工精度满足细胞培养要求。

图4 不同温度梯度（a）及pH梯度（b）下水凝胶微流控芯片的溶胀率Fig.4 The swelling ratio of hydrogelmicrofluidic chip at different temperature（a）and pH（b）

图5 显微镜下部分特征性芯片实物图。十字交叉微孔通道结构（a）,芯片弯道结构（b）Fig.5 Microscope image ofmicrofluidic chip′s characteristic structure.（a）,Crossmicrochannel,（b）bend structure

3.4 细胞捕获培养

当细胞悬液流体流经这些芯片微孔通道时,重力作用使微孔自动捕获细胞,直至向下凹陷0.3 mm的微孔内充满细胞混合液,通过微通道,细胞悬液继续流向下一个微孔,多余的细胞悬液会自发的汇聚至检测槽内被移出芯片内。孔道因其剪切力大,细胞很难附着。微孔阵列所捕获的细胞在特定微孔中生长,便于原位细胞观察和分析,有效地避免了流体剪切力对细胞的损伤,利于芯片细胞的平均分布和后期代谢物的表达。图6可清晰观察出微孔接种细胞前（a）和接种细胞后（b,c）对细胞的捕获结果。

图6 不同时间段显微镜下芯片微孔捕获细胞培养图,A为进样前微孔结构显微图,B为进样后细胞被捕获孵育1 h后的显微图片,C为捕获孵育后局部放大图Fig.6 Microscope images ofmicro-well（a）before capture of cells and（b）after cell culture for 1 h in the hydrogel chip；（c）is themagnified image of（b）

3.5 代谢液检测指纹图谱

5种不同正常肺细胞（MRC-5,BEAS-2B,HFL1,HFL-I和IMR-90）及5种不同肺癌细胞（95C, 95D,A549,NCIH446和HCC827）的可视化指纹图谱见图7,肉眼可见对于不同的细胞代谢物传感阵列表现出完全不同的特征性图谱,且各样本的响应程度不同。肺癌细胞与正常肺细胞图谱响应差别很大,肺癌细胞代谢物起反应的特异性阵列点远多于正常肺细胞,且正常肺细胞之间的指纹图谱响应差别较小,响应点的位置也相对固定。

3.6 聚类分析

聚类分析（HCA）是对数据之间的相关程度进行分析,后进行分类的一种多元统计分析方法,可分析出实验样本间的相似度与差异性。平方欧氏距离越小,代谢物间差异就越小。图8的聚类分析图显示了10组试样的平行样,在平方欧氏距离＜5时,皆呈现明显聚集现象,表明各平行样之间差异较小且变化幅度稳定,且正常肺细胞与肺癌细胞都能进行组内聚类。尤其是在平方欧氏距离=6时,正常肺细胞全部聚类在一起,说明人正常肺细胞代谢液间差异较小。在平方欧氏距离=25时,两大类细胞代谢液汇聚在一起,说明代谢物差异也在不断增大。

图7 不同正常肺细胞和肺癌细胞的可视化指纹图谱,每次实验取3次平行样结果Fig.7 Colorimetricmaps of pigment-based arrays for different lung cellmetabolites,and all experiments were run in triplicate

3.7 主成分分析

主成分分析（PCA）是一种分析、简化数据集的分析手段,通过减少数据维度,保留低阶主成分,忽略高阶主成分,保持对方差贡献最大的值,衡量数据的稳定度非常可靠。实验选取16种特异性染料,取前10种累积方差贡献较大的成分作为分析值,最主要的10维主成分包含了全部数据99.952％的信息量。如图9所示,前两种主成分占总信息量的78.8％。由图10所示的二维主成分分析图可见,在由64.6％和14.2％两种主成分为轴的平面空间内同种细胞平行样彼此的空间距离相距不远,团簇状况非常明显,有些平行样之间甚至发生重合现象。蓝色圈内的正常肺细胞之间空间距离相聚较近,而紫色圈内的肺癌细胞在空间上距离较远,直观的表现出各试样代谢物之间的差异性。肺癌细胞代谢物差异较大,是因为各个时期的癌细胞代谢物不同,尤其是人小细胞肺癌和人高转移肺癌细胞等分裂繁殖都较快,恶化程度快,治愈难,与人肺腺癌细胞和人低转移肺癌细胞等细胞代谢物有较大差异,其代谢物中特异性分泌物的种类和数量远远超过正常肺细胞和肺癌早期阶段存在的肺癌细胞。由于这几种肺癌细胞所对应的病变程度差异大,故它们代谢物之间也存在较大差异。但正常肺细胞与肺癌细胞所代表的分布区别明显。检测结果证明了在微孔阵列芯片上进行肺癌细胞培养及相关检测的可行性,集成的传感器检测元件能够直观的对不同肺癌细胞代谢物进行准确区分。

图8 5种肺癌细胞和5种正常细胞代谢物的聚类图Fig.8 Hierarchical cluster analysis dendrogram of metabolites of 5 normal lung cells and 5 different lung cancer cells

4 结论

建立了一种精度高、加工快速、成本低廉的水凝胶芯片加工方法,设计制作出集细胞分离、捕获、培养、观察和检测等功能性微结构单元于一体的微孔阵列芯片。通过溶胀率测试证明了此芯片在正常室温和37℃体温以及中性生理pH范围下能保持结构的稳定性和适用性；红外光谱表征证明了芯片各单体发生了有效的聚合反应,形成了设计所需的无毒、高亲水性、生物相容性好材料特性的芯片。芯片设计尽量模拟了肺部组织结构特点,芯片上的微孔尺寸能调控细胞分布,均匀的分散细胞有利于观察和数据的稳定性,有利于细胞真实形态及活性的表达,有效降低流体剪切力对细胞的损伤；交错微通道实现了流体的均匀传递,从而减小流体剪切力。微流控芯片集成的卟啉传感可视元件,可在芯片原位收集槽处进行收集、检测,过程方便,快捷,迅速,且不涉及液相,液质等大型仪器的使用,费用低廉,该可视化分析系统可对肺细胞及肺癌细胞代谢液做出准确区分,结果具有稳定性和直观性。故此基于微孔阵列的肺癌细胞培养的代谢液检测芯片平台为医学研究提供了一种全新的可行性检测方法。

图9 前10种主成分的累计贡献值柱状图Fig.9 Histogram of the cumulative variance contribution values of the first10 kinds of principal components

图10 正常肺细胞与肺癌细胞代谢液基于前二主成分分析散点图Fig.10 Plot of the first two principal components by principal component analysis（PCA）of metabolites of normal lung cells and lung cancer cells

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（Received 23 April 2015；accepted 10 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.81171414,81271930）and the Key Technologies R＆D Program of China（No.2012BAI19B03）

Development of 3D Hydrogel M icrofluidic Chip for Lung Cancer Cells Capture and Detection

HUO Dan-Qun1,GUOMing-Yi1,DENG Yan1,YANG Mei1,FA Huan-Bao2,HOU Chang-Jun*11（College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China）
2（College ofChemical Engineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China）

Based on photopolymerization property of poly（ethylene glycol）diacrylate（PEGDA）,a 3D nontoxic,hydrophilic and biocompatible hydrogelmicrofluidic chip（60 mm×20 mm×3 mm）,was specifically designed and fabricated.2-Hydroxyethyl methacrylate（HEMA）was used to increase hydrophilicity of the chip,and 1-vinyl-2-pyrrolidone（NVP）was added to improve its toughness.The swelling ratio testing and the infrared spectrum characterization showed that the hydrogelmicrofluidic chip had excellent performance and stability.A colorimetric sensor array with 16 specific dyeswas integrated into the chip for real-time detection of themetabolites of lung cells.The colorimetric value of themaps was extracted for calculating the squared Euclidean distance.The results of principal componentanalysis（PCA）suggested that themetabolic liquids of different lung cells could be easily distinguished.Thirty normal lung cell and lung cancer cell samples could be accurately clustered by hierarchical cluster analysis（HCA）.The fabricated hydrogel microfluidic chip provides a novelmethod for clinically diagnosing.

Microfluidic chip；Lung cancer；Metabolites detection；Visual sensor array

10.11895/j.issn.0253-3820.150333

2015-04-23收稿；2015-08-10接受

本文系国家自然科学基金（Nos.81171414,81271930）、国家科技支撑计划项目（No.2012BAI19B03）、重庆市研究生科研创新项目（No.CYB14028）和重庆大学大型仪器设备开放基金资助

E-mail：houcj@cqu.edu.cn