基于聚吡咯-铟锡氧化物微电极的细胞阻抗生物传感器构建及细胞生物学行为信息检测

李远袁国林夏春勇于超（重庆医科大学生命科学研究院,重庆40006）（重庆医科大学附属永川医院,永川4060）

基于聚吡咯-铟锡氧化物微电极的细胞阻抗生物传感器构建及细胞生物学行为信息检测

李远1,2袁国林1夏春勇1于超*11（重庆医科大学生命科学研究院,重庆400016）2（重庆医科大学附属永川医院,永川402160）

采用光刻技术蚀刻感光干膜绝缘层制备铟锡氧化物（ITO）微电极,采用循环伏安法在ITO微电极表面电沉积聚吡咯（PPy）膜制备PPy-ITO微电极。用电化学阻抗谱技术考察PPy膜厚度对PPy-ITO微电极阻抗特征的影响,人肺癌细胞株A549粘附增殖实验考察PPy-ITO电极细胞生物相容性。以PPy-ITO微电极为传感电极,通过电化学阻抗谱技术和等效电路拟合技术对A549细胞粘附增殖及上皮间充质转变（EMT）过程进行检测和分析。结果表明,与裸ITO微电极相比,在最优参数下制备的PPy-ITO微电极（电沉积5个循环）具有更优的电化学阻抗性质和细胞生物相容性。基于PPy-ITO微电极的细胞阻抗生物传感器能够解析A549细胞粘附增殖及EMT过程中细胞质膜电容、细胞-细胞间隙电阻、细胞-聚吡咯膜间隙电阻变化检测。

生物传感器；电化学阻抗谱；聚吡咯；铟锡氧化物

1 引 言

细胞阻抗生物传感器是一类以固定在电极表面的活细胞作为敏感原件,以电化学阻抗谱检测细胞响应行为的生物传感器[1]。由于细胞阻抗生物传感器能够无标记、定量地分析细胞粘附、增殖、凋亡等生物学行为[2～4],在药物筛选[5]、毒物测试[6]及细胞生理病理机制研究[7]等领域具有潜在应用价值。在细胞阻抗生物传感器研究中,电极表面的细胞固定与活性保持是细胞对外界刺激响应的基础,因此构建兼具细胞生物相容性和导电性的传感电极是其研究的关键。

当前,细胞阻抗生物传感器的传感电极常采用惰性金属导电材料,如金[8]、铂[9]或铟锡氧化物[10],生物相容性较差,采用新型生物材料进行表面修饰是改善电极细胞生物相容性的重要方法[11]。聚吡咯作为一种共轭导电聚合物,具有本征导电性、表面性质可控、稳定性好及低电位聚合制备等优点,可作为电化学生物传感器[12]的电极修饰材料。此外,聚吡咯膜还是一种重要的组织工程材料[13]和神经探针电极修饰材料[14],可为神经细胞[15]、内皮细胞[16]、心肌细胞[17]等提供粘附与增殖位点。Ding等在ITO电极表面修饰了碳纳米管掺杂的聚吡咯纳米复合膜,证实该复合物界面适宜细胞粘附和增殖,通过电化学阻抗谱技术检测了ECA-109细胞的粘附和增殖[18]。Ateh等利用聚吡咯修饰的金电极进行细胞阻抗检测,结果表明,聚吡咯修饰电极能够提高传感器检测灵敏度[19]。然而,上述报道的细胞阻抗生物传感器采用大尺寸传感电极,通过检测溶液中氧化还原探针电子转移阻抗的变化实现电极表面上细胞数量的检测,未能进一步分析细胞生物学过程行为学信息。本研究构建了ITO微电极,研究了聚吡咯修饰在改善电极本征阻抗特征和细胞生物相容性方面的作用。以PPy-ITO微电极为传感电极,在无氧化还原探针情况下通过电化学阻抗谱技术对人肺癌细胞株A549粘附增殖和EMT过程进行检测,利用等效电路拟合技术解析上述过程中细胞质膜电容、细胞-细胞间隙电阻、细胞-聚吡咯膜间隙电阻的变化。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CS315电化学工作站（武汉科斯特仪器有限公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Veeco MultimodeⅧ原子力显微镜（瑞士Veeco公司）；IX71倒置光学显微镜（奥林巴斯公司）。ITO导电玻璃（珠海凯为光电科技有限公司）,面电阻≤7Ω/mm2,用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗15min,烘干待用。HF90二氧公碳细胞培养箱（力康生物医疗科技集团）；离心机（德国Eppendorf公司）。

吡咯单体（Sigma-Aldrich公司）,氮气保护蒸馏,-20℃储存；硫酸葡聚糖（Dextran Sulfate,DS,Sigma-Aldrich公司）；转化生长因子-β1（TGF-β1,以色列Prospec公司）。其它试剂均为分析纯。实验用水为去离子水（≥18 MΩcm）。CCK-8分析液、异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽（江苏省海门碧云天生物技术公司）。人肺癌上皮细胞A549在含10％胎牛血清（杭州四季青）、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPIM-1640培养液（Gibco）中,37℃,5％CO2条件下培养；待细胞生长至对数生长期,用0.25％胰酶（含0.02％EDTA）消化细胞,1500 r/min离心4min,收集细胞。

2.2 ITO微电极加工及聚吡咯膜电化学沉积

ITO微电极采用光刻技术对感光干膜绝缘层蚀刻而成：将一层感光干膜（HQ-6100,感光层厚度为35μm,长兴化学工业股份有限公司）通过覆膜机 （100℃）压贴在ITO导电玻璃表面（6.0 cm× 2.5 cm）,透过掩膜胶片对感光干膜紫外光照射30 s,30℃下用1％Na2CO3溶液对感光干膜显影5min,使未经紫外光照射区域的感光干膜溶解露出ITO电极,去离子水冲洗2次,60℃烘干,紫外光照射60 s,使感光胶完全固化。ITO微电极直径为1.0 mm,如图1a所示。

电化学小池装置结构示意图如图1b所示,ITO微电极和测量小池用塑料夹具固定,使ITO微电极置于测量小池底部,整个装置含4个独立的测量小池,每个小池直径为8mm,体积为500μL。聚吡咯膜电沉积采用电化学循环伏安法,以ITO微电极为工作电极,以Ag/AgCl丝（10 mm×0.5 mm）和铂丝（10 mm×0.1 mm）分别作为参比电极和辅助电极,如图1c所示。聚合溶液含0.1 mol/L吡咯单体和1mg/mL硫酸葡聚糖（DS）,聚合电压设为0～0.7 V（vs.Ag/AgCl）,扫描速度20 mV/s,膜厚度通过循环数控制。用原子力显微镜对聚吡咯模形貌进行表征。

图1 氧化铟锡（ITO）微电极（a）,和电化学测量池装置结构示意图（b）、实物图（c）Fig.1 Indium tin oxide（ITO）microelectrode（a）,structure diagram（b）,picture of electrochemical cells（c）

2.3 聚吡咯膜细胞生物相容性研究

ITO电极上电沉积的聚吡咯膜细胞的生物相容性通过细胞粘附与增殖行为进行评价。按上述相同聚合参数,在直径6 mm ITO电极上沉积聚吡咯膜,70％乙醇浸泡30min消毒,无菌去离子水冲洗,干燥待用。将100μL A549细胞悬液以浓度为5.0×104cells/mL接种在电化学测量小池内,放入细胞培养箱,静置2 h,使细胞在小池底部聚吡咯表面粘附与铺展。以裸ITO电极、玻璃和细胞培养皿材料聚苯乙烯做对照实验。细胞显微形态学通过倒置光学显微镜观察,CCD相机获取细胞粘附和铺展的相差显微图像。

细胞在聚吡咯膜上的增殖行为通过Cell Counting Kit（CCK-8）实验评价。将100μL A549细胞悬液（2.0×104cells/mL）分别接种在含聚吡咯膜的测量小池和传统聚苯乙烯96孔板内,细胞培养箱中培养24和48 h,随后加入10μL CCK-8分析液,轻摇混匀,37℃孵育2 h,分别取测量小池和96孔板内溶液100μL,用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度。

2.4 PPy-ITO微电极上细胞粘附增殖生物学行为电化学阻抗检测

将100μL A549细胞悬液以浓度为2.0×104cells/mL加载到PPy-ITO微电极的测量小池内,室温条件下静置30min,使细胞均匀沉降到PPy-ITO微电极表面,随后放入细胞培养箱中分别培养2,24和48 h,PBS冲洗除去死细胞及未粘附细胞,随后将辅助电极和参比电极插入测量小池进行电化学阻抗谱测量。实验以未加载细胞的PPy-ITO微电极作为对照组。电化学阻抗谱测量以0.01mol/L PBS作为支持电解质溶液,开路电压下对电极施加幅值为10 mV的正弦波交流检测信号,频率扫描范围为1～105Hz,阻抗谱数据用ZView 2.0软件（Scribner Associates,Southern Pines,NC,USA）建立等效电路拟合分析。

2.5 TGF-β1诱导A549细胞上皮间充质转变（EM T）生物学行为电化学阻抗分析

将100μL 1.0×106cells/mL A549细胞悬液加载到含PPy-ITO传感电极的测量池内,室温下静置30min,放入细胞培养箱培养24 h,A549细胞在传感电极上增殖形成细胞单层。再将测量小池内细胞培养液换成含10 ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）培养液,以未加入TGF-β1的培养液为对照,分别培养12,24和36 h后测量电化学阻抗谱。A549细胞骨架用异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽进行荧光染色。

3 结果与讨论

3.1 PPy-ITO微电极加工

电化学循环伏安法聚合聚吡咯膜的循环伏安曲线如图2a所示。随着扫描圈数增加,氧化电流增大,说明聚吡咯膜成功沉积在ITO微电极表面,且提高了电极的导电性和电化学活性。图2b为电沉积5个循环的聚吡咯膜AFM图像,可以看出电沉积在ITO微电极表面的聚吡咯膜由直径约为50 nm均匀粒子组成,表面粗糙度为（12.54±0.36）nm（n=3）。

图2 ITO微电极表面上电化学循环伏安法沉积聚吡咯膜.（a）循环伏安曲线.（b）聚吡咯膜AFM图片Fig.2 Electropolymerization of polypyrrole（PPy）on the surface of ITO microelectrode by electrochemical cyclic voltammetry.（a）Cyclic voltammogram.（b）AFM image of PPy film

3.2 PPy-ITO微电极电阻抗特性表征及PPy膜厚度优化

图3a为ITO微电极和PPy-ITO微电极电化学阻抗谱。在1～103Hz扫描频率范围间,PPy-ITO微电极阻抗幅值低于ITO微电极阻抗幅值,其原因在于聚吡咯膜电沉积,使电极表面粗糙度和表面积增加,表面双分子层电容增大,电极阻抗值降低[20]。在1～104Hz扫描频率范围,PPy-ITO微电极相位角低于ITO微电极,说明PPy-ITO微电极比ITO微电极更趋向电阻性质。其原因在于聚吡咯表面粗糙,且包含大量的空隙,电解质渗入空隙内,使得电极具电阻特征[20]。PPy-ITO微电极的低阻抗幅值和电阻特征有利于提高传感器检测灵敏度[21]。图3b为沉积不同循环圈数PPy-ITO微电极阻抗幅值频率曲线。结果表明,PPy-ITO微电极阻抗随电沉积循环圈数增加而降低。此结果与文献[20]报道的电极阻抗随聚吡咯聚合时间延长而降低的结论一致。图3c为电沉积不同循环数的PPy-ITO微电极放大图像,可见聚吡咯膜均匀沉积在ITO微电极表面,且随着电沉积循环次数增加,聚吡咯膜厚度增大,颜色变深。当电沉积循环圈数增加至6及以上,聚吡咯膜表面张力增大,容易发生褶皱,并从ITO微电极上脱落。因此,后续实验选择电沉积循环5圈制备PPy-ITO微电极。

3.3 PPy-ITO电极细胞生物相容性评价

由不同基底上接种A549细胞2 h后细胞粘附和铺展的显微形态图片（图4a）可见,聚吡咯膜上粘附的A549细胞均开始铺展,而ITO电极表面和玻璃表面的A549细胞仍呈圆形,几乎不见铺展的细胞。同时,聚苯乙烯表面上A549细胞也开始铺展,但铺展细胞比例小于聚吡咯膜。上述结果说明,PPy-ITO电极更有效地促进A549细胞的粘附和铺展,有利于细胞在电极表面固定。图4b为在PPy-ITO电极表面培养24和48 h时A549细胞的相对增殖率。结果表明,在PPy-ITO电极表面培养的细胞相对增殖率高于聚苯乙烯基底,这也说明PPy-ITO电极能促进A549细胞增殖,具有优异的细胞生物相容性。

图3 （a）ITO微电极和PPy-ITO微电极电化学阻抗谱.（b）聚合循环数分别为1～10时的PPy-ITO微电极的阻抗频率曲线.（c）PPy-ITO微电极显微图像Fig.3 （a）Electrochemical impedance spectra of ITO and PPy-ITO microelectrodes.Impedance spectrocopy （b）and microscopy images（c）of PPy-ITOmicroelectrodeswith different electrodepositon cycle numbers from one to ten

图4 PPy-ITO电极细胞生物相容性评价.（a）A549细胞接种2 h时的相差显微镜图像.（b）A549细胞在PPy-ITO电极上相对细胞增殖活性.实验以聚苯乙烯基底上接种A549细胞24 h时活性作为对照。Fig.4 Cell biocompatibility evaluation of PPy-ITO electrode.（a）Phase contrastmicroscopy images of A549 cells after inoculated for 2 h.（b）Relative viability of A549 cells cultured on PPy-ITO.The viability of A549 cells after cultured on polystyrene substrate for 24 h was used as control

3.4 PPy-ITO微电极上细胞粘附增殖行为的电化学阻抗谱表征

由A549细胞接种在PPy-ITO微电极上不同时刻对应的电化学阻抗谱复平面图（图5a）可见,A549细胞在PPy-ITO微电极上的粘附和增殖导致电极阻抗谱高频部分的半圆特征发生改变,且随着细胞增殖,半圆直径增大,说明电极界面上的细胞增殖导致电子转移过程速度减慢,其原因可能与细胞质膜电容充电效应有关[19]。另外,在低频区域,A549细胞的增殖未对电极阻抗谱产生明显变化。图5b为对照PPy-ITO微电极的阻抗谱复平面图,其高频区域半圆特征未发生明显改变。上述结果说明了图5a中高频区半圆直径的变化是由细胞粘附与增殖引起的。

PPy-ITO微电极等效电路模型采用含Warburg元件和常相位元件（CPE）的Randles电路[22],利用该电路对0h的PPy-ITO微电极阻抗谱进行非线性最小二乘曲线拟合,获得PPy-ITO微电极等效电路模型中各元件初始值（图5c）。细胞等效电路由一个RC并联电路和一个R元件串联组成[22]。其中,Rs′为细胞-电极的间隙电阻,Rcell为细胞-细胞电阻,Ccell为细胞质膜的电容效应。将图5a的电化学阻抗谱数据与图5c的等效电路模型拟合,细胞增殖不同时刻的等效电路各元件拟合结果如图5d所示。结果表明,Ccell在2～24 h快速增加,24 h后趋于稳定,约为8.7 nF,此数值变化与细胞粘附增殖过程中细胞厚度降低、铺展面积增大、细胞离子通道数量和开闭有关[23]。此外,细胞的Rcell值和Rs′值均持续增加,形成细胞单层时（48 h）,Rcell≈1655Ω,Rs′≈268Ω。Rcell值持续增加说明细胞-细胞间的间隙逐渐缩小,细胞融合度增加[24]；Rs′值增加则提示细胞与PPy-ITO电极间间隙缩小,细胞粘附强度增强[24]。

图5 PPy-ITO微电极上细胞粘附增殖行为的电化学阻抗谱检测。（a）接种A549细胞0,2,24和48 h 时PPy-ITO微电极典型的阻抗谱复数平面图；（b）未接种细胞的PPy-ITO微电极典型阻抗谱复数平面图；（c）PPy-ITO微电极等效电路模型（左）和细胞等效电路模型（右）串联；（d）PPy-ITO微电极上接种A549细胞不同时刻的细胞等效电路模型各元件值拟合值（n=3）Fig.5 Cell adhesion and proliferation behaviors on PPy-ITO microelectrode measured by electrochemical impedance spectroscopy.（a）Typical electrochemical impedance spectra of PPy-ITO microelectrodes recorded at0,2,24 and 48 h after inoculation of A549 cells；（b）Typical electrochemical impedance spectra of PPy-ITOmicroelectrodeswithout cells inoculation；（c）Equivalent circuitmodel of PPy-ITO microelectrode（left）and Equivalent circuitmodel of cell（right）in series；（d）Curve fit results for the equivalent circuitmodel of A549 cells after inoculation on PPy-ITOmicroelectrodes at different time interval（n=3）

3.5 PPy-ITO微电极测量TGF-β1诱导A549细胞的上皮间充质转变（EM T）生物学过程

图6a为TGF-β1诱导A549细胞36h后细胞骨架荧光染色图像。结果显示,对照组A549细胞呈典型的鹅卵石样上皮形貌,而实验组A549细胞形态更趋向呈纤维梭状细胞样,细胞间连接变弱,应力纤维增加。此结果与文献[25]相符,证实A549细胞在TGF-β1诱导作用下成功发生EMT过程。图6b为A549细胞EMT过程中不同时间点细胞等效电路元件值变化曲线,TGF-β1处理12 h时,实验组Ccell低于对照组Ccell；在24和36 h时,实验组Ccell高于对照组Ccell,证明肿瘤细胞EMT过程中出现的细胞膜波动、细胞面积增大和细胞应力纤维增加等形态学变化[25]。此外,实验组Rs′和Rcell值均比对照组Rs′和Rcell值低,且随着TGF-β1处理时间延长,差值增大。实验组Rs′降低提示细胞与基底间间隙增大,粘附力减低,此结果与文献[26]的实验结果（细胞EMT过程细胞与基底间粘附力降低）吻合。Rcell值降低则提示细胞-细胞间连接变弱,这与A549细胞EMT过程细胞连接蛋白E-钙黏着蛋白表达减低有关[25]。

图6 （a）A549细胞的细胞骨架荧光染色图片.（b）TGF-β1处理A549细胞不同时刻细胞等效电路模型各元件值拟合值（n=3）Fig.6 （a）Cytoskeletion fluorescence images of A549 cells.（b）Curve fit results for the equivalent circuit model of A549 cell after treatmentwith TGF-β1 for different time

4 结论

采用光刻技术制备ITO微电极,在ITO微电极表面电沉积PPy膜制备PPy-ITO微电极。通过电化学阻抗谱技术和等效电路拟合技术对微电极表面上的A549细胞粘附增殖及EMT过程进行检测分析。结果表明,PPy-ITO微电极具有优良的电化学阻抗特性和细胞生物相容性,基于此电极构建的阻抗生物传感器可对细胞生物学行为信息进行检测。

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（Received 14 May 2015；accepted 25 August2015）

This work was supported by the Natural Science Foundation Project of CQ CSTC（cstc2012jjA10046）,Innovation Ability Platform Project of Yongchuan District（Ycstc,2014bf5001）and the Key Research Project of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University（YJZD201302）

Construction of a Cell Im pedance Biosensor Based on Polypyrrole-Indium Tin Oxide M icro-Electrode for Detecting Cell Biology Behavior

LIYuan1,2,YUAN Guo-Lin1,XIA Chun-Yong1,YU Chao*11（Institute of Life Sciences,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China）
2（Central Laboratory of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University,Yongchuan 402160,China）

An indium tin oxide（ITO）microelectrode was fabricated by etching the insulating layer of photosensitive dry film using lithography technology,then polypyrrole（PPy）layer with different thicknesswas electrodeposited on the surface of the ITOmicroelectrode by electrochemical cyclic voltammetry to get PPy-ITO microelectrode.The effect of the thickness of PPy layer on the impedance characteristic of PPy-ITO microelectrode was examined by electrochemical impedance spectroscopy（EIS）.The biocompatibility of the PPy-ITOmicroelectrodeswas investigated by adhesion and proliferation experiment of human lung cancer cell A549.Finally,using PPy-ITO microelectrode as sensing electrode,biology information on the adhesion, proliferation and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549 was tested and analyzed by EIS and equivalent circuit fitting.The results showed that the PPy-ITO microelectrode prepared under optimal parameter（electrodeposition for five cycles）had a lower electrical impedance and a better cell compatibility than bare ITOmicroelectrode.The changes of cytoplasm membrane capacitance,intercellular resistance and the gap resistance between cell and polypyrrole film during the processes of adhesion,proliferation and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549 could be detected by a cell impedance biosensor based on the PPy-ITOmicroelectrode.

Biosensor；Electrochemical impedance spectroscopy；Polypyrrole；Indium tin oxide

10.11895/j.issn.0253-3820.150396

2015-05-14收稿；2015-08-25接受

本文系重庆市科委自然科学基金计划资助项目（cstc2012jjA10046）；重庆市永川区创新能力建设平台项目（Ycstc,2014bf5001）；重庆医科大学附属永川医院院级重点研究项目（YJZD201302）资助

E-mail：yuchaom@163.com