羟丙基壳聚糖在水溶液中的聚集行为研究

王雪 程晓敏（安徽大学化学化工学院,合肥230039）

羟丙基壳聚糖在水溶液中的聚集行为研究

王雪 程晓敏*
（安徽大学化学化工学院,合肥230039）

在乙酸-水-甲醇体系中,通过改变乙酸酐用量,对壳聚糖进行乙酰化反应,再以异丙醇为溶剂,环氧丙烷与碱化后的N-乙酰化壳聚糖反应制备了不同脱乙酰度（DD 98％～55％）的羟丙基壳聚糖（HPCS）。核磁和红外光谱结果表明,羟丙基化的取代过程主要发生在C3-OH和C6-OH上。采用带有光散射检测器的凝胶渗透色谱（GPC-MALS）、动态光散射（DLS）、荧光光谱法和原子力显微镜（AFM）研究了HPCS在水溶液中的聚集行为。结果表明,在水溶液中,HPCS主要以单链分子和聚集体形式存在。HPCS中乙酰基的相对含量影响临界聚集浓度（CAC）,DLS测得DD为98％和75％HPCS的CAC值分别为1.09和1.67mg/mL,与芘荧光探针法基本一致。水溶液中,HPCS聚集体存在两种分布,一种为成膜堆砌高度低于13 nm,轮廓长度约为70～200 nm的小尺寸聚集体,占大多数；另一种成膜堆砌高度约为13～31.4 nm,轮廓长度约200～610 nm的大尺寸聚集体,约占20％。

羟丙基壳聚糖；光散射；聚集行为

1 引 言

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后形成的功能化多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性及无毒性,并被广泛应用于医药、化妆品、食品添加剂等领域[1～3]。由于壳聚糖在应用时很多情况下须溶解在弱酸溶液中,壳聚糖产品的性能与其分子结构和溶液性质有重要的关系,壳聚糖在溶液中聚集行为的研究受到了广泛关注。壳聚糖具有交联聚集的特性,在分析化学领域也常用作吸附剂[4]。Wu等[5]采用动态光散射法研究了壳聚糖水溶液中扩散系数与分子量的关系,具有伸展链构象的壳聚糖倾向形成聚集体,甚至在低分子量电解质的存在下仍可以发生聚集。Yanagisawa等[6]采用尺寸排除色谱-多角度光散射法研究了不同分子量和不同脱乙酰度壳聚糖的溶液性质。壳聚糖溶液中残余微量的乙酰基团（低至2％）就能够引起聚集体的产生,导致溶液的非均一性,且无法避免或去除。

由于壳聚糖不溶于水和许多有机溶剂,在很大程度上限制了它的应用。人们通过烷基化、羧甲基化和季氨化等多种化学改性反应得到水溶性的壳聚糖衍生物[7～9]。羟丙基壳聚糖（HPCS）是一种重要的壳聚糖衍生物,具有良好的水溶性、抗菌和抗凝等特点,广泛应用于药物、皮肤修复和组织工程等领域[10～13]。目前,HPCS的相关研究多集中在制备方法[10,14～16]和应用[11～13]等方面,而在中性水溶液中聚集行为的研究尚未报道。为了更好地拓展HPCS在生物领域,特别是药物传输方面的应用,研究其聚集行为是至关重要的[17～19]。

本实验制备了不同脱乙酰度的HPCS,用红外光谱及核磁共振探究了其微观结构；采用带有光散射检测器的凝胶渗透色谱（GPC-MALS）、动态光散射（DLS）、荧光光谱法和原子力显微镜（AFM）研究了HPCS在水溶液中的聚集行为,为HPCS在医药领域的应用提供依据。

2 实验部分

2.1 试剂

壳聚糖（生化试剂,成都市科龙化工试剂厂）；1,2-环氧丙烷、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、氨水、乙醚、冰醋酸等（分析纯,国药化学试剂有限公司）；NaCl（色谱纯,天津光复科技发展公司）；芘（95％,萨恩化学技术有限公司）；实验用水均为超纯水。

2.2 不同脱乙酰度羟丙基壳聚糖的制备

参照文献[20],通过改变乙酸酐和壳聚糖的摩尔比（约为0～0.6）,制备脱乙酰度为98％,88％, 75％,67％和55％的壳聚糖,编号为CS-R（R=1～5）。产物置于40℃真空烘箱中干燥24 h。

不同脱乙酰度羟丙基壳聚糖的合成路线见图1。在三颈瓶中加入2 g CS,5 mL 40％（w/V）NaOH 和20 mL异丙醇,室温下搅拌碱化1 h,然后加入5 mL 9％（V/V）的四甲基氢氧化铵和20 mL环氧丙烷,室温下搅拌30 min后升温至60℃,搅拌反应6 h,反应结束后用15％（V/V）HCl溶液中和至中性,用丙酮沉淀出产物,并多次洗涤沉淀物。最后,真空干燥至恒重。即可得到不同脱乙酰度的羟丙基壳聚糖HPCS-R（R=1～5）。

图1 不同脱乙酰度羟丙基壳聚糖的合成路线Fig.1 Synthesis procedure of hydroxypropyl chitosans（HPCS）with different degrees of deacetylation（DD）values

2.3 HPCS结构表征

NEXUS-870型傅里叶变换红外仪（美国尼高利公司）：KBr压片法,波长扫描范围在4000～500 cm-1,分辨率4 cm-1。Bruker 400 MHz型核磁共振仪（NMR,瑞士布鲁克公司）：以重水（D2O）为溶剂,四甲基硅烷（TMS）为内标。

2.4 HPCS聚集行为研究

GPC-MALS-RI体系（美国Wyatt公司）,主要包括凝胶渗透色谱柱（GPC）、DAWN HELEOS-Ⅱ多角激光光散射检测器（MALLS）和Optilab Rex型示差检测器（RI）,采用AstraV软件处理数据。样品浓度为2mg/mL（w/V）,进样量50.0μL,激发波长658 nm,以0.1 mol/L NaCl溶液为流动相,流速0.5 mL/min,测试温度25℃。

Hitachi F-7000型荧光光谱仪（日本Hitachi公司）：1 cm石英池,激发狭缝和发射狭缝带宽均为5 nm,激发波长337 nm,发射光波范围360～440 nm,扫描速度300 nm/min。芘在水中的最终浓度6.0×10-7mol/L。

CSPM500型原子力显微（AFM）（中国纳米本原）：测试膜尺寸为10 mm×10 mm。采用轻敲模式在大气环境、室温下进行成像观察。

3 结果与讨论

3.1 不同脱乙酰度羟丙基壳聚糖的微观结构

3.1.1 红外图谱分析由不同脱乙酰度壳聚糖的FT-IR光谱图（图2a）可见,壳聚糖乙酰化后,保持了在3450 cm-1处的OH与NH 的伸缩振动重叠而成的宽峰。2920 cm-1附近甲基或次甲基的CH伸缩振动吸收峰增强,1655和1310 cm-1处出现了较为明显的酰胺和酰胺特征峰,1550 cm-1出现了新的酰胺特征峰。说明壳聚糖发生了乙酰化反应。此外,随着乙酰度的增加,1600 cm-1处的NH2吸收峰强度逐渐减弱,说明壳聚糖的乙酰化主要发生在NH2上。图2b为羟丙基壳聚糖（HPCS-5）的FT-IR光谱图。对比CS-5,HPCS-5在2973和1376 cm-1处出现新峰,分别属于CH3中的CH伸缩振动吸收峰和弯曲振动峰,表明CS与环氧丙烷反应后,CS分子链上引入了CH3。另外,1030和1160 cm-1（分别归属于CS上3-OH和6-OH的C-O振动吸收峰）消失,表明羟丙基化取代过程主要发生在 C3OH和C6OH上。

3.1.2 核磁氢谱分析由HPCS的1H-NMR谱图（图3）可知,δ=1.1附近出现了明显的CH3质子峰,证明在壳聚糖分子链上引入了羟丙基[8]；δ=2.02处是甲壳素脱乙酰化不完全残留的乙酰基（OCCH3）的甲基质子峰,δ=2.56～2.81是C2上H的振动吸收峰；δ=3.57～3.9归属于C3-C8上H的振动吸收峰。

图2 （a）不同脱乙酰度壳聚糖和（b）羟丙基壳聚糖的红外谱图Fig.2 FTIR spectra of（a）chitosan（CS）with different DD values and（b）HPCS

图3 羟丙基壳聚糖的1H-NMR谱图Fig.31H-NMR spectrum of HPCS

3.2 CPC-MALS-RI信号分析

由不同脱乙酰度HPCS样品的激光光散射（LS）和示差指数（RI）信号（图4）可见,RI信号为单峰,而LS信号中则含有两个峰。HPCS-1的 LS信号中,高淋洗体积（约为7.2 mL）处的峰代表HPCS的单链分子。低淋洗体积（约为5.5 mL）处的小肩峰对应的RI示差信号峰很小,这种LS 和RI信号之间不匹配的关系意味着其溶液体系具有不均一性。与之类似,HPCS-2～5样品的LS和RI信号也呈现了类似现象,说明HPCS-2～5水溶液同样具有不均一性,存在聚集体。随着 HPCS分子中乙酰基含量的增加（HPCS-2→HPCS-5）,聚集体的峰面积增大,分子量范围为3.16×105～8.35×105g/mol；而单链分子的峰面积减小,分子量范围为1.13×105～1.75×105g/mol,但RI信号峰面积基本没有变化。说明聚集体的存在与HPCS中乙酰基的含量有关。乙酰基含量越高,聚集体数目越多。

3.3 光散射强度分析

当溶液中高分子链发生聚集时,随着聚集体数不断增加,光散射强度会不断增强。因此利用散射光强度-溶液浓度曲线中的突变点可以确定临界聚集浓度。HPCS光散射强度随浓度变化的关系见图5。

利用曲线中的突变点得到HPCS-1和HPCS-3的CAC分别为1.09和1.67mg/mL。由此可见, HPCS的CAC值随乙酰基团量的增加而增大。结果表明,疏水基团N-乙酰基团含量增加,促进了HPCS的聚集。可能是因为HPCS分子链上羟丙基、氨基及羟基的存在,使分子间形成较强的氢键,同时疏水基团例如乙酰基和糖苷环之间的相互作用导致HPCS聚集。

图4 不同脱乙酰度HPCS光散射（LS）和相对示差（RI）检测器的GPC图Fig.4 Gel permeation chromatogram（GPC）of HPCS samples with various DD values from light scattering （LS）and refractive index（RI）detectors

图5 HPCS光散射强度随浓度变化图Fig.5 Light scattering intensity as a function of HPCS concentration

图6 HPCS水溶液中芘的I1/I3值随羟丙基壳聚糖浓度变化图Fig.6 Variation of I1/I3with HPCS concentration in aqueous solution

3.4 荧光光谱分析

芘荧光探针法是普遍采用的测定高分子在水溶液中临界聚集浓度的方法。图6为芘荧光光谱中羟丙基壳聚糖样品的I1/I3随浓度变化的曲线。根据芘荧光光谱中的I1/I3强度比值的水平部分与急剧下降部分的曲线转折点可作为壳聚糖的 CAC[21],得到 HPCS-1和 HPCS-3的 CAC分别为1.05和1.73mg/mL。

综上可知,动态光散射法可以方便地测定高分子在水溶液中的临界聚集浓度,且测定结果与芘荧光探针法基本一致。

3.5 AFM形貌分析

采用AFM观测到羟丙基壳聚糖（图7）尺寸分布不均匀的聚集体。羟丙基壳聚糖溶液中的聚集体存在两种分布,一种为高度低于13 nm,轮廓长度约为70～200 nm的小尺寸聚集体,占大多数；另一种高度约为13～31.4 nm,轮廓长度约200～610 nm的大尺寸聚集体,约占20％。Winnik等[22]在研究壳聚糖溶液性质时发现,壳聚糖存在少量的聚集,且不同壳聚糖分子很可能通过片段之间的侧向连接发生聚集。羟丙基基团引入壳聚糖分子链并没有改变壳聚糖本身的结构,所以羟丙基壳聚糖分子间的聚集也是通过片段之间的侧向连接而发生的。

图7 HPCS聚集体的AFM图Fig.7 AFM images of HPCSaggregates

4 结 论

通过改变乙酸酐与壳聚糖的摩尔比,制备了脱乙酰度为98％～55％的HPCS。GPC-MALS结果表明,HPCS在水溶液中可以发生聚集,且聚集体的存在与HPCS所含乙酰基的量有关。通过光散射和稳态荧光光谱法确定了HPCS聚集体的CAC,两种测量的结果接近,CAC数值随着HPCS中乙酰基含量的增加而增大。在HPCS水溶液中,存在两种不同尺寸的聚集体,尺寸范围分别为200～610 nm和70～200 nm,其中大尺寸的聚集体,约占20％。

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（Received 20 May 2015；accepted 10 August2015）

Study on Aggregation Behavior of Hydroxypropyl Chitosan in Aqueous Solution

WANG Xue,CHENG Xiao-Min*
（College ofChemistry and Chemical Engineering,Anhui University,Hefei230039,China）

Hydroxypropyl chitosan（HPCS）with various degrees of deacetylation（DD 98％-55％）was successfully prepared by the reaction of pre-basified N-acetylchitosan and propylene epoxidewith ispropanol as solvent.The acetylations of chitosan at N-position were carried out by changing the dosage of acetic anhydride in acetic acid-water-methanol solution.The hydroxypropyl substitutionmainly occurred atboth C3-OH and C6-OH groups,which was approved by FTIR and1H-NMR.The aggregation behavior of HPCS samples was carefully investigated by gel permeation chromatography with multi-angle light scattering（GPC-MALS）, dynamic light scattering（DLS）,fluorescence spectrometry and atomic forcemicroscope（AFM）.The results indicated that HPCS single chains and aggregates were coexistence in aqueous solution.With the increasing content of N-acetyl of HPCS, the apparent aggregation number increased. The critical aggregation concentration（CAC）from DLSwere 1.09mg/mL for HPCSwith DD 98％and 1.67mg/mL for HPCSwith DD 75％,which were consistent with the results of pyrene probe fluoresce spectrometry.The content of N-acetyl groups had an effect on the CAC values.Two types of HPCS（DD 55％）aggregates occurred in aqueous solution.Themajority was smaller aggregates with lower than 13 nm in height after film pilling and 70-200 nm in length,while the minority（about 20％）was comparatively larger aggregates with about 13-31.4 nm in height after film pilling and 200-610 nm in length.

Hydroxypropyl chitosan；Light scattering；Aggregation behavior

10.11895/j.issn.0253-3820.150416

2015-05-20收稿；2015-08-10接受

本文系安徽省绿色高分子重点实验室和教育部创新团队培育计划资助项目

E-mail：xmcheng@adu.edu.cn