磁性固相萃取-液相色谱法测定环境水样中痕量的微囊藻毒素

连丽丽郭亭秀吴玉清金丽娄大伟孙大志（吉林化工学院分析化学系,吉林30）（吉林大学无机与超分子国家重点实验室,长春300）

磁性固相萃取-液相色谱法测定环境水样中痕量的微囊藻毒素

连丽丽1郭亭秀1吴玉清2金丽1娄大伟*1孙大志*11（吉林化工学院分析化学系,吉林132022）2（吉林大学无机与超分子国家重点实验室,长春130012）

通过水热合成法制备出磁性膨润土复合材料作为固相萃取吸附剂,采用磁性固相萃取（MSPE）前处理技术,结合高效液相色谱-紫外检测器（HPLC/UV）,建立了对环境水中痕量生物污染物微囊藻毒素（MC-LR）的快速检测分析方法。通过对MSPE技术中吸附剂用量、吸附时间、洗脱溶剂的配比、体积等参数的优化,实现水样中MC-LR的最优提取。在最优条件下,检出限和定量限分别为0.75和1.5 ng/L,远低于国际卫生组织所制定的饮用水中微囊藻毒素所允许的最高浓度。目标物在0.25～250μg/L范围内表现出良好的线性（R2=0.9993）。本方法所用的磁性固相萃取吸附剂具有制备简单、价格低、易于固液分离等优点,配合HPLC/UV可实现环境水样中痕量MC-LR的快速、灵敏监测。

磁性；固相萃取；微囊藻毒素；高效液相色谱

1 引 言

固相萃取技术（SPE）具有富集能力强,操作简单等优点,近年来被广泛应用于环境分析、食品分析、生物分析等样品前处理领域[1,2]。但是,SPE存在柱成本较高,对特定分析物选择性差,且需要大量有机溶剂进行萃取柱的预处理及目标物质的洗脱等制约因素[3]。基于 SPE的不足,磁性固相萃取（MSPE）作为一种新型样品前处理技术迅速发展起来,并引起了研究者的广泛关注。MSPE使用磁性纳米材料作为目标分析物的载体,具有易于功能化修饰、比表面积大、分散性强、便于固液分离等优势。MSPE操作简单、对分析物富集效率高,并可以实现某些分析物在复杂基质中的选择性分离。该方法也避免了SPE在处理生物、环境样品时常出现的柱堵塞问题。目前,MSPE已被成功应用于环境水中多种有机污染物、无机金属离子污染物的高效富集,配合HPLC、GC等检测手段,实现了复杂样品中痕量污染物的准确定性与定量分析[4～7]。

微囊藻毒素（MCs）是由蓝藻水化所产生的一类生物污染物,目前已发现80余种结构极为相似的异构体,其中微囊藻毒素MC-LR为分布最广、毒性最强的一种构型[8,9]。MCs的靶向器官为肝脏,长期饮用含有高浓度MCs的饮用水甚至可能诱发肝癌,而且MCs可以通过食物链作用进行生物富集,具有持久性生物污染[10]。MCs性质稳定,耐高温及极端pH,常规自来水工艺也不能将其有效去除。鉴于MCs污染的普遍性及其较强的毒性,世界卫生组织[11]及我国《生活饮用水卫生标准》[12]均规定生活饮用水、地表水源地MCs的浓度不得高于1.0μg/L（以MC-LR为代表）。由于环境水样基质复杂,而且极低浓度的MCs已经构成了生物毒素污染,因此需配合必要的样品前处理技术并结合HPLC等分析方法对MCs进行准确监测。近年来,基于磁性纳米吸附剂的MSPE技术在痕量有机、无机污染物萃取分离领域已取得了一定的进展。但是,将MSPE-HPLC应用于水样中生物污染物的检测研究较少。目前,以磁性膨润土作为吸附剂的磁性固相萃取-高效液相色谱法检测环境水样中MCs的研究还未见报道。我们的前期工作制备了CoFe2O4磁性纳米材料,用于去除水中微囊藻毒素[13]。在此基础上,本研究制备出十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）修饰的磁性膨润土复合材料,并以此作为固相萃取吸附剂,通过对萃取条件和洗脱条件的优化,结合HPLC/UV分析,建立一种操作简便、稳定性好、绿色环保的环境水样中痕量生物污染物MC-LR的定量分析方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津科技有限公司）,配置SPD-20A紫外检测器；KQ-500D型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；XW-80A型旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

微囊藻毒素MC-LR（色谱纯,台湾藻研公司）；甲醇、乙腈（色谱纯,天津大茂化学品有限公司）；膨润土（化学纯,天津光复化学试剂有限公司）；三氟乙酸（TFA,色谱纯,上海阿拉丁公司）；Mill-Q超纯水（美国Millipore公司）；其它试剂均为分析纯。

2.2 标准溶液的配制

移取500μLMC-LR（50μg/mL）标准品,置于10 mL洁净的棕色螺纹口透明玻璃瓶,配制成浓度为5.0μg/mL的MC-LR储备溶液5 mL,4℃下保存备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm,5μm,Agilent科技有限公司）；检测波长：238 nm；流动相：乙腈-H3PO4（35∶65,V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.4 固相萃取吸附剂的制备

2.4.1 磁性膨润土（Fe3O4@B）的制备称取膨润土0.5 g,三氯化铁（FeCl3·6H2O）1.35g,无水醋酸钠3.60g,聚乙二醇1.00 g,溶于40 mL乙二醇中,将混合物搅拌20min后转入50 mL不锈钢反应釜中密封,置于190℃烘箱中反应8 h。冷却后的液体转移至100 mL烧杯中,磁性分离出磁性膨润土Fe3O4@B,用水和无水乙醇充分洗涤,并溶于100 mL水,分散均匀。

2.4.2 磁性有机膨润土（Fe3O4@B@CTAB）的制备将上述混合溶液超声10min后,转移到250 mL三口烧瓶中,加入0.5 g CTAB,室温反应24 h。制得的Fe3O4@B@CTAB通过外加磁场分离,以水多次洗涤,60℃真空干燥,装瓶备用。

2.5 磁性固相萃取MC-LR

20 mL水中加入30μL 5.0μg/mLMC-LR标准品,得到7.5μg/L MC-LR溶液。将适量Fe3O4@B @CTAB加入到上述溶液中,旋涡振荡20min后,使用磁铁将吸附了MC-LR的Fe3O4@B@CTAB集中于样品瓶底部,弃去上清液。随后加入400μL乙腈-0.1％TFA水溶液（3∶1,V/V）洗脱液,超声20min,吸取含有MC-LR的洗脱液,用氮气浓缩并定容至200μL,以HPLC进行定量分析。

2.6 采样和水样处理

环境水样取样于蓝藻生长旺盛的中国太湖（2015年7月）,取样后4℃下保存于棕色玻璃瓶中。水样首先在10000 r/min下离心10min弃去沉淀物,并将上清液通过0.45μm的滤膜。然后将MSPE吸附剂分散于20 mL上述溶液中,萃取其中的MC-LR,经过洗脱,定容到200μL后,HPLC定量分析。

3 结果与讨论

3.1 Fe3O4@B@CTAB的制备与表征

近期研究发现,磁性铝柱撑膨润土可有效去除环境水中的生物污染物MC-LR[14]。而CTAB修饰的膨润土@Fe3O4复合材料,不但具有较强的磁性,而且可以实现大体积样品中痕量MC-LR的高效萃取及有效洗脱,配合HPLC精准检测低浓度环境水中的生物污染物MC-LR。

图1A为Fe3O4@B@CTAB的FT-IR谱图。其中580 cm-1为Fe3O4的FeO弯曲振动吸收峰；1035 cm-1处的强烈吸收带归属于膨润土中SOSi骨架振动；而在2925,2850和1475 cm-1处为季铵盐中CH伸缩振动以及氨基的特征吸收。结果表明,已成功制备出功能化磁性膨润土复合材料Fe3O4@B@CTAB。Fe3O4@B@CTAB的TGA结果如图1B所示,当温度由室温上升至100℃,吸附剂失去表面水分；当温度由200℃升至600℃,Fe3O4@B@CTAB失去CTAB及膨润土的层间水。此曲线说明Fe3O4@B@CTAB具有良好的热稳定性。

图1 磁性膨润土的性能表征：（A）FT-IR谱图；（B）TGA曲线Fig.1 Characterization ofmagnetic sorbent：（A）FT-IR spectrum；（B）Thermogravimetric curve

3.2 萃取条件优化

3.2.1 磁性吸附剂的用量分别将1,2,3,4和6 mg的磁性吸附剂用于萃取分离20 mL加标溶液中的MC-LR,考察磁性吸附剂用量对萃取效率的影响,结果见图2A。当吸附剂的质量增大至2 mg,萃取效率显著增大,而当吸附剂加入量由2 mg继续增大至6 mg时,萃取效率逐渐减小。这是因为Fe3O4@B@CTAB对MC-LR具有较强的富集能力,少量吸附剂即可实现大体积样品中MC-LR的有效萃取,而较大量的吸附剂反而给MC-LR的有效洗脱带来困难。因此选择固相萃取吸附剂的加入量为2 mg。

图2 （A）吸附剂的加入量对萃取效率的影响；（B）溶液pH值对萃取效率的影响；（C）萃取温度对萃取效率的影响；（D）萃取时间对萃取效率的影响Fig.2 Effect of（A）weight of sorbents,（B）solution pH,（C）solution temperature and（D）extraction time on the extraction performance

3.2.2 萃取剂的pH值溶液的pH值直接影响吸附剂与吸附质的表面电荷分布。由于修饰了有机长链分子CTAB,Fe3O4@B@CTAB表面带有大量的正电荷,而且随着pH值降低,其表面所带正电荷数目增多；在pH 2.1～12之间时,生物分子MC-LR表面带有负电荷[13]。因此,当pH=2.1时,带有大量正电荷的Fe3O4@B@CTAB对MC-LR分子具有更强的萃取能力；随着溶液pH值继续升高,Fe3O4@B@CTAB表面正电荷的数目逐渐减少,静电力的减弱导致其对MC-LR萃取效率逐渐降低（图2B）。

3.2.3 萃取温度考察了萃取温度（20℃,30℃,40℃,50℃）对实验结果的影响。如图2C所示,当温度由20℃升高至40℃,Fe3O4@B@CTAB对MC-LR的萃取效率逐渐提高；当萃取温度继续升高至50℃,萃取效率逐渐降低。固相萃取过程是目标分子在固相萃取吸附剂表面不断发生吸附和解吸附的动态平衡过程,当温度由20℃升高至40℃,分子运动速率加快,分析物MC-LR分子能够快速扩散至吸附剂表面并达到动态的吸附平衡；而继续升高温度,可能加速了MC-LR在吸附剂表面解吸附速率,导致萃取效率下降。

3.2.4 萃取时间在保证较高萃取效率的前提下应尽量缩短萃取时间提高分析效率。如图2D所示,萃取时间介于1～10min时,随着萃取时间的延长,萃取效率逐渐增大；随后萃取时间增大反而导致了萃取效率的降低。基于以上实验结果,选择10min为最佳萃取时间。

3.3 洗脱条件的优化

3.3.1 洗脱液的选择洗脱液的选择也是影响萃取效率的关键因素。考察了不同比例（0％,25％, 50％,75％,100％）乙腈-水对MC-LR萃取效率的影响,结果表明,纯水和纯乙腈溶液都不能将MC-LR从吸附剂表面洗脱；洗脱剂的组成为75％乙腈-水溶液,得到的萃取效率最高。溶液的酸度也可能影响MC-LR的洗脱过程,在洗脱液中加入不同比例的三氟乙酸,萃取结果如图3A所示,当三氟乙酸浓度从0％增加到0.6％,萃取效率随之增加；当三氟乙酸的浓度继续增大,萃取效率增加较小,由于三氟乙酸易挥发,因此选择75％乙腈-1.0％TFA作为洗脱液。洗脱液的体积（100,200,400,600μL）也是影响萃取效率的重要因素。结果表明,400μL的洗脱液足以获得满意的萃取效率,继续增大洗脱液体积基本不会改变萃取结果。

3.3.2 洗脱时间和洗脱温度的选择为快速、高效地将MC-LR从MSPE吸附剂表面洗脱,在超声辅助下,考察洗脱时间对萃取效率的影响。如图3B所示,15min后继续延长洗脱时间,将降低萃取效率,因此洗脱时间选择15min。

当洗脱温度介于20℃～60℃之间,随着温度升高,萃取效率逐渐降低,这说明较低的温度可以使MCLR从固相萃取吸附剂表面有效洗脱；继续降低温度至10℃,萃取效率反而下降,这可能是溶液的温度过低降低了MC-LR分子的解吸附速率,使萃取效率降低。因此选择20℃对MC-LR进行洗脱（图3C）。

图3 TFA含量（A）；超声时间（B）和超声温度（C）对萃取效率的影响Fig.3 Effect of（A）amounts of trifluoroacetic acid（TFA）,（B）desorption time and（C）desorption temperature on extraction performance

3.4 方法评价

配制浓度为0.25,2.5,25,50,125和250μg/L的MC-LR标准溶液,在最优条件下进行样品前处理,在确定的色谱条件下,以待测组分的响应值对相应的质量浓度绘制标准曲线。本方法在0.25～250μg/L质量浓度范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,标准曲线方程为y=1158.7x-1101.5,相关系数为0.9993。检出限0.75 ng/L。

3.5 回收率和精密度

在不含MC-LR组分的环境水样品中添加MC-LR标准溶液,配制0.25,25和250μg/L（低、中、高）3个浓度水平的MC-LR溶液,按照上述方法进行MSPE处理、并将每个水平平行测定6次,计算回收率和精密度。3个添加水平的平均回收率分别为89.0％,93.3％和93.3％,相对标准偏差（RSD）为12.7％,3.5％和5.6％。

3.6 实际样品检测

实际样品于2015年7月8日取自蓝藻生长旺盛的太湖。将20 mL水样经0.45μm水系膜过滤后,用建立的基于Fe3O4@B@CTAB材料的MSPE方法对太湖中的MC-LR进行萃取,并通过HPLC/UV检测,获得实际水样中MC-LR的浓度为1.4μg/L。此结果表明太湖中微囊藻毒素应予以重视。

3.7 与其它方法比较

将建立的MSPE-HPLC法与目前常用的SPE-HPLC相比（表1）,结果表明,本方法具有较低的检出限；较宽的线性范围,且Fe3O4@B@CTAB制备成本低,无需大量有机溶剂活化即可实现MC-LR的高效洗脱。因此,本方法更加绿色环保。结果表明,本实验成功建立了测定环境水样中生物污染物MCLR的MSPE-HPLC/UV分析方法。此方法仅需2.0 mg磁性吸附剂、涡旋萃取10min、400μL洗脱溶剂、15min的洗脱时间即可实现20 mL水样中痕量MC-LR的高效富集、检测。该方法具有价格低、有机溶剂消耗少、检出限低等优势。

表1 MSPE与SPE前处理方法对MC-LR检测结果对比Table 1 Comparision of the developed analyticalmethod and the literature methods

1 GiakisikliG,Anthemidis A N.Anal.Chim.Acta,2013,789：1-16

2 BAISha-Sha,LIZhi,ZANG Xiao-Huan,WANGChun,WANG Zhi.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41（8）：1177-1182

白沙沙,李芝,臧晓欢,王春,王志.分析化学,2013,41（8）：1177-1182

3 Lan H,Gan N,Pan D,Hu F,Li T,Long N,Qiao L.J.Chromatogr.A,2014,1331：10-18

4 Mohamed EM,Somia B A,Maher M O,Tarek M A F.Fuel.,2015,139：614-621

5 WANG Chao,PENG Tao,LÜYi-Bing,TENG En-Jiang.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41（12）：1844-1850

王超,彭涛,吕怡兵,滕恩江.分析化学,2013,41（12）：1844-1850

6 Zhao B S,He M,Chen B B,Hu B.Spectrochim.Acta B,2015,107：115-124

7 Yang J,Li JY,Qiao JQ,Cui SH,Lian H Z,Chen H Y.Appl.Surf.Sci.,2014,321：126-135

8 Qiu T,Xie P,Liu Y,LiG Y,Xiong Q,Hao L,Li H Y.Toxicology,2009,257：86-94

9 Nobre A C L,Jorge M CM,Meezes D B.Braz.J.Med.Biol.Res.,2009,32：985-988

10 YANG Jing-Dong,HU Liang-Bin,ZHOUWei,CHEN Jian,SHIZhi-Qi.Ecology.Environ.Sci.,2009,18（6）：2044-2050

杨静东,胡梁斌,周威,陈健,石志琦.生态环境学报,2009,18（6）：2044-2050

11 World Health Organization.Guidelines for Drinking-Water Quality,3rd Edition.Geneva：World Health Organization,2004

12 GB/T 5749-2006,Standards for Drinking Water Quality.National Standards of the People′s Republic of China

生活饮用水卫生标准.中华人民共和国国家标准.GB/T 5749-2006

13 LIAN LI-Li,CAO Xue-Ling,WU Yu-Qing,LOU Da-Wei.Journal of Instrumental Analysis,2015,34（10）：1095-1100

连丽丽,曹雪玲,吴玉清,娄大伟.分析测试学报,2015,34（10）：1095-1100

14 Lian L L,Cao X L,Wu Y Q,Sun D Z,Lou DW.Appl.Surf.Sci.,2014,15：245-251

15 Lee J,Walker H W.Colloid.Surface.A,2011,373：94-100

16 GUO Jian,YANG Xin-Lei,YE Ming-Li.Chinese J.Anal.Chem.,2011,39（8）：1256-1260

郭坚,杨新磊,叶明立.分析化学,2011,39（8）：1256-1260

17 FENG Gui-Xue,LIU Li,WANG Ming-Quan,SUN Shao-Hua,JIA Rui-Bao.Chemical Analysis and Meterag,2014, 23（6）：34-36

冯桂学,刘莉,王明泉,孙韶华,贾瑞宝.化学分析计量,2014,23（6）：34-36

18 HE Xiao-Min,LIAi-Min,YANG Deng,MA Xian-Feng,SONG Guo-Qiang.Environmental Monitoring in China,2012, 28（1）：53-56

贺小敏,李爱民,杨登,马先锋,宋国强.中国环境监测,2012,28（1）：53-56

19 ZHANGWei-Hao,XU Xiao-Qing.Chinese J.Anal.Chem.,2001,29（5）：522-525

张维昊,徐小清.分析化学,2001,29（5）：522-525

20 Shan Y H,Shi X Z,Dou A,Zou C J,He H B,Yang Q,Zhao SM,Lu X,Xu GW.J.Chromatogr.A,2011,1218：1743-1748

（Received 15 July 2015；Accepted 18 September 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21375046,21405058）,Science and Technology Development Plant of Jilin Province（No.20130521024JH）,The research Foundation of education bureau of Jilin Province（No.2015438）

Determ ination of M icrocystin-LR in EnvironmentalW ater by M agnetic Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

LIAN Li-Li1,GUO Ting-Xiu1,WU Yu-Qing2,JIN Li1,LOU Da-Wei*1,SUN Da-Zhi11（Department ofAnalytical Chemistry,Jilin Institute ofChemical Technology,Jilin 132022,China）
2（State Key Laboratory for Supramolecular Structure and Materials,Jilin University,Changchun 130012,China）

A rapid analyticalmethod was established for the determination of trace amounts ofmicrocystins （MC-LR）in environmentalwater samples by magnetic solid phase extraction（MSPE）coupled with HPLC/UV based on a magnetic bentonite sorbent fabricated by solvothermal synthesis method.Several factors influencing the extraction efficiency of MC-LR,such as sorbent amount,pH condition,sample volume, adsorption and desorption time,and desorption solvent were investigated and optimized.Under the optimal extraction conditions,the limits of detection and quantification for themethod were 0.75 ng/L and 1.5 ng/L respectively,which was far below the guideline recommended by theWorld Health Organisation.Themethod showed a good linearity（R2=0.9993）in the ranges of0.25-250μg/L for MC-LR.The MSPE sorbentwas simple in preparation,low cost andmagnetizable,and the developed MSPE-HPLVmethod was suitable for the rapid and sensitive determination of MC-LR in nature water samples.

Magnetic；Solid phase extraction；Microcystins；High performance liquid chromatography

10.11895/j.issn.0253-3820.150567

2015-07-15收稿；2015-09-18接受

本文系国家自然科学基金（Nos.21375046,21405058）,吉林省科技发展计划项目（No.20130521024JH）,吉林省教育厅"十二五"科学技术研究项目（No.2015438）资助

E-mail：4159495@163.com