原位磷酰化衍生-核磁共振法鉴定非磷化学毒剂前体

黄桂兰袁铃 刘石磊 周世坤（国民核生化灾害防护国家重点实验室,防化研究院,北京102205）

原位磷酰化衍生-核磁共振法鉴定非磷化学毒剂前体

黄桂兰*E-mail：hglhdm@163.com袁铃 刘石磊 周世坤
（国民核生化灾害防护国家重点实验室,防化研究院,北京102205）

1H谱鉴定复杂基质中禁止化学武器公约附表2的非磷化学毒剂前体化合物存在困难,一种替代方法是采用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环（CTMP）为衍生试剂,在核磁管中原位衍生含羟基的前体化合物并进行磷31-核磁共振谱测定。采用频哪醇及3个同分异构体氨基醇类化合物：2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇,考察了方法的专一性、稳定性、灵敏度和选择性。结果表明,本方法的衍生反应产物单一,稳定性好,能清楚分辨同分异构体的氨基醇。本方法成功应用于禁止化学武器公约组织（OPCW）指定核查实验室第32次官方水平考试,实现了有机液样品中3个氨基醇同分异构体混合物（原始浓度10μg/mL）的检测及鉴定。

磷31-核磁共振；原位衍生；非磷前体；化学毒剂；氨基醇；磷酰化

1 引 言

二烷氨基乙醇、频哪醇、烷基二乙醇胺是一类在制药工业和化学毒剂合成中具有广泛用途的化合物,其中二烷（甲、乙、正丙、异丙）氨基乙基-2-醇和频哪醇被列为《禁止化学武器公约》附表2中B类前体化合物；乙基二乙醇胺、甲基二乙醇胺和三乙醇胺是附表3中B类前体化合物[1]。这些化合物作为监控化学品,是联合国禁止化学武器公约组织（OPCW）指定核查实验室的水平考试、质疑核查、反化学恐怖等行动中的检测目标化合物。在实际的环境样品和生物样品基质中,这类化合物的含量通常很低,在应用核磁共振技术直接检测这些化合物时,只能采用氢谱（1H NMR）检测方法[2]。由于1H谱化学位移范围仅有十几ppm,一个醇类化学毒剂前体化合物常存在多个1H NMR信号峰,并且每个峰多为多重峰,多数背景有机物的信号与这类化合物出现在相同区域,造成严重的背景干扰；另外,这些化合物存在相似结构,当它们同时存在样品中时,信号互相重叠。在OPCW指定核查实验室的水平考试中,核磁技术明确鉴定化合物的技术标准规定谱图中目标化合物的所有谱峰均不受掩盖[3]。因此,在实际样品检测中,1H NMR常无法满足明确鉴定的要求。

核磁共振的磷谱（31P NMR）比氢谱的化学位移范围宽得多,化学武器相关化合物的磷谱位移范围一般在-30～200 ppm。在对氢去偶的条件下,31P{1H}NMR的谱峰信号表现为单峰,具有高分辨和高灵敏度的特点。另外,与一般基质中含大量碳氢有机物不同,含磷化合物很少,磷谱检测背景干扰很小。由于醇类化合物具有可供反应的活泼羟基,因此可以通过衍生反应的方式,将其转换为含磷化合物,再应用31P{1H}NMR技术来检测鉴定。磷衍生化的方法和试剂的种类繁多,磷酸/磷酸酐、磷酰卤、磷酸酯及磷酰胺、环状磷酰化剂等可用于直接磷酰化方法；间接磷酰化方法可利用烷基化剂、亚磷酰化剂、缩合剂和醇活化等[4]。本研究组曾利用PCl3在核磁管中原位磷酰化衍生的方法,实现了酒石酸对映体纯度的磷谱测定[5]。含有1,3,2-二噁磷杂环的化合物是一类广泛用于衍生含OH基团的醇、酚和羧酸的磷酰化试剂[6],其中的2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环（CTMP）多应用于木材[7]和食品[8,9]中组分的磷谱定量分析,并已用于化学式武器分析[10]。本研究选择CTMP为磷酰化试剂,研究了原位磷衍生化反应的产物专一性、稳定性、灵敏度、选择性等特点,应用于OPCW指定核查实验室第32次官方水平考试中,成功鉴定了公约附表中浓度为10μg/mL氨基醇化合物的同分异构体。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Varian NMR System 600超导核磁共振波谱仪（美国Varian公司）,600 MHz、5 mm脉冲梯度场双通道宽带多核共振探头,工作站软件VnmrJ 2.1B和VnmrJ 4.0。

2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环（CTMP,分析纯,美国Sigma-Aldrich公司）；氘代氯仿（CDCl3,99.8％氘代度,含0.03％TMS,CIL公司）；氘代NaOH（CIL）；吡啶（分析纯,北京化工厂）。频哪醇、2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇、2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇及其与CTMP衍生反应产物的标准品由防化研究院第四研究所提供,经过本实验室核磁共振氢谱和磷谱测定,纯度＞95％。

2.2 原位磷酰化反应

氨基醇化合物溶解于经过无水氯化钙干燥的氘代氯仿,取0.7 mL转移入核磁管中,先后加入2～10μL等体积的吡啶和CTMP,摇匀,室温下放置1 h,进行31P{1H}NMR检测。

2.3 有机液样品的制备

2 mL有机液样品用3×0.5mL D2O萃取,萃取液调至pH=12,用3×0.3 mL CDCl3反萃取并用无水Na2SO4干燥后,转移入核磁管中,加入10μL CTMP和10μL吡啶,混匀并于室温下放置反应1 h 后,31P{1H}NMR检测,随后继续加入适量醇胺-CTMP衍生产物的合成标准品,重测磷谱,验证产物峰重合。在0.7 mL CDCl3中同样加入等量CTMP和吡啶作为空白样品对照。

2.4 磷谱检测条件

31P{1H}NMR检测条件：31P核共振频率：242.812 MHz；谱宽sw=59523.8 Hz；射频中心位置：tof=26305.8 Hz；射频功率：tpwr=54 dB；90度脉冲宽度：pw90=9.75 ms；检测脉冲宽度：pw=3.25 ms；脉冲延迟时间：d1=0.3 ms；采样时间：at=1 ms；氢去偶射频功率：dpwr=42 dB；去偶方式：dm=′yyy′；去偶频率中心：dof=0；采样点：np=119048；滤波带宽：fb=15000；接收机增益：gain=20；检测温度：25℃；化学位移定标是先采用85％H3PO4作为外标,确定CTMP的化学位移,在后续的实验中以CTMP的化学位移定标。

3 结果与讨论

3.1 磷酰化试剂的选择

理想的核磁管中原位磷酰化反应要求满足以下条件：（1）反应温和,反应温度不能超过溶剂的沸点,最好在室温下进行；（2）反应迅速,能在1 h内反应完全；（3）反应产物单一,因为检测的目标化合物浓度常在μg/mL浓度水平,反应产物若超过一个,造成产物浓度分散,达不到检测浓度；（4）反应专一,抗基质干扰能力强,适用于复杂基质,避免复杂的样品净化过程。CTMP在室温下可与醇、酚和羧酸在吡啶中定量反应,衍生产物用磷谱测定,具有谱峰分辨率好、稳定的优点[11～14],已成为定量分析木材中的木质素[15～17]、食品油中含羟基的甘油、甘油酯、脂肪酸、固醇、多酚类等组分[18]、生物汽油/柴油中甘油三酸酯、甘油和脂肪酸含量[19～21]、考古中的脂质类化合物[22],以及评估纤维素反应活性[23]的有效手段。

CTMP与醇类化合物在室温下进行反应的原理如图1所示。吡啶作为缚酸剂,中和反应产生的HCl,促使反应平衡向磷酰化产物方向进行。

图1 醇与CTMP磷酰化反应Fig.1 Phosphitylation of alcohols using 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphspholane（CTMP）

3.2 磷酰化反应产物的专一性和稳定性

对于1～10μg/mL浓度水平的醇类化合物,要求其磷酰化产物有足够的稳定性,以满足31P{1H}谱测试时所必需的长时间累加的要求,同时要求产物单一,反应完全,以保证31P{1H}谱检测所必需足够的产物浓度。如图2A所示,CTMP在氘代氯仿中的化学位移是176.457 ppm,与其它文献报道一致。图2A显示,频哪醇的氘代氯仿标准溶液中不存在其它含磷杂质化合物。将过量CTMP和氘代吡啶加入到频哪醇/氘代氯仿溶液的核磁管中,混匀,分别在0.5,2,6,12和48 h后测试31P{1H}谱,结果如图2B所示：与图2A（CTMP）相比,176.457 ppm的CTMP峰显著降低,在147.457 ppm处出现了一个磷酰化产物2-频哪基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环的峰。图2A（CTMP）和图2B中,19 ppm峰是两个CTMP分子与1个水分子反应,脱去两个HCl分子,形成的二聚体化合物[24]。该峰在后面的图3C中比图2A（CTMP）明显增高,是因为空气及氘代氯仿中含水,加入频哪醇的氯仿标准溶液的操作增加了水分与CTMP的反应。图2结果表明,频哪醇与CTMP发生了磷酰化反应,只有一种含磷产物。图2B中残余的176 ppm峰说明CTMP保证过量。不同时段检测的31P{1H}谱结果相似,说明反应后的体系是稳定的。

图2 31P{1H}NMR谱：（A）CTMP和频哪醇；（B）频哪醇与CTMP的原位磷酰化衍生Fig.231P{1H}NMR spectra：（A）CTMP and pinacol；（B）in situ phosphorylation of pinacol using CTMP

3.3 磷酰化反应产物的分辨率

在同一体系中往往存在多种醇类化合物,应用磷酰化反应产物作为鉴定依据的前提,要求不同的反应产物之间有足够的分辨率,能相互区分。选择3个同分异构体的氨基醇化合物：2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇、2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇、2-（N,N-二丙氨基）乙醇,分别测定各自的原位磷酰化反应体系和三者混合后的原位磷酰化反应体系的31P{1H}谱,如图3所示。3个同分异构体的衍生产物在磷谱上的化学位移非常接近,相差不到0.5 ppm,仅靠测试标样的磷谱来比对化学位移值难以确定对应的化合物,通过增大3个同分异构体的含量差值或单标加入的方式,根据产物信号强度比例,分辨出对应的化合物如图3A所示。对于同分异构体的氨基醇化合物的磷酰化衍生,其磷酰化产物的磷谱谱峰可以区分识别,满足鉴定要求。

Mazumder等[10]认为这种方法不能识别非对称的氨基醇,但本实验结果表明,非对称的同分异构体2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇与CTMP的原位衍生化产物在31P谱上的谱峰完全分离,化学位移差值达到0.37 ppm。文献[10]采用400兆核磁共振波谱仪进行31P{1H}谱检测,而本研究在600兆波谱仪上检测,具有更高的分辨率,另外匀场条件和样品状态也对谱峰的分辨率有直接影响。

3.4 磷酰化反应的灵敏度

根据OPCW水平考试配样标准中规定的考试样品基质中添加的检测目标化合物的浓度水平不小于1μg/mL的要求[25],以氘代氯仿为溶剂,配制了频哪醇、2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇4种化合物的混合标准溶液,浓度分别为5,10,20,50 和100μg/mL,各取0.7 mL加入5 mm核磁管中,加入等体积的吡啶和CTMP各2～10μL。化合物摩尔比计算表明,各加入1μL吡啶和CTMP时,对于上述浓度的溶液,已能保证CTMP过量。31P{1H}谱检测结果表明,2～10μL不同体积的吡啶和CTMP对磷酰化产物的检测结果并无明显影响。相比于Mazumder等[10]报道的方法,本方法不需要预先配制CTMP的氘代氯仿溶液和进行细致的计算,实验操作上更简单、反应到终点更快。在5μg/mL浓度水平下,累加次数15000次,累加时间5.5 h,窗函数lb=3时,4种磷酰化产物的31P{1H}谱峰的信噪比大于9,已经满足定性鉴定的要求。由于本实验中核磁共振仪器的含磷化合物的31P{1H}谱检测灵敏度约为5μg/mL,因此,未测试1μg/mL的浓度水平。

图3 氨基醇与CTMP原位磷酰化衍生后的31P{1H}NMR谱：（A）3种氨基醇的混合样品；（B）2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇；（C）2-（N,N-二丙氨基）乙醇；（D）2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇Fig.331P{1H}NMR spectra of in situ phosphorylation of aminoalcohols：（A）themixture of three aminoalcohols；（B）2-（N-Isopropyl-N-propylamino）ethanol；（C）2-（N,N-Dipropylamino）ethanol；and（D）2-（N-Butyl-N-ethylamino）ethanol

3.5 磷酰化反应的选择性

以上的磷酰化反应是在化合物的氘代氯仿标准溶液中进行的,没有样品基质的影响,而考试化合物的样品基质中总要添加干扰背景化合物,如果原位磷酰化反应可以直接应用于含干扰的基质溶液,将可以省略样品净化的制备步骤,大大提高样品的分析鉴定效率。为此,本研究将4种化合物的混合标准溶液分别加入到两种基质中,一种基质组成是含500μg/mL汽油的十二烷,另一种是含0.5％柴油的正己烷。目标化合物的添加水平为5,10和50μg/mL。加入吡啶和CTMP进行原位磷酰化反应后,检测31P{1H}谱。基质中如果含微量水或其它与CTMP反应的组分,会导致CTMP不足,因此在开始31P{1H}谱累加时,需要先确认存在CTMP的峰,如在176 ppm位置无峰,需补充吡啶和CTMP。实验结果表明,在保证CTMP过量的条件下,3个浓度水平下的4种磷酰化产物峰均能检出,但是当醇的浓度水平低于10μg/mL时,需要的累加次数大大增加,累加时间延长。如图4所示,在含0.5％柴油的正己烷的基质溶液中,4种醇的浓度在50μg/mL时,累加次数800次时,磷酰化产物的信噪比已经完全符合鉴定要求,并且不受干扰。但醇的浓度在10μg/mL时,累加次数30000次时,磷酰化产物的信噪比勉强达到定性鉴定的要求,同时在检测目标物峰的相近位移处出现其它杂质峰,有的峰与目标产物峰重叠,干扰目标峰的检出和识别。而4种醇的浓度为5μg/mL的混合CDCl3标准溶液的磷酰化衍生后的31P{1H}谱中并未出现这些杂峰,可见这些杂峰来自基质溶液存在的化合物。因此,对于复杂基质中低浓度水平的醇类化合物的直接原位磷酰化衍生,衍生产物的磷谱检测可能会受到干扰,需对样品进行净化和浓缩后,再进行磷酰化衍生。

3.6 磷酰化反应的实际应用

第32次OPCW官方水平考试有机液样品的基质是在十二烷中添加了500μg/mL汽油、浓度均为10μg/mL的2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇[26]。针对同分异构体的部分谱峰重叠和基质干扰,导致1H谱无法作为明确鉴定数据的问题,采用了磷酰化原位衍生的鉴定技术途径。本研究先用重水萃取有机液样品,再用氘代氯仿反萃取处理,原位磷酰化衍生氘代氯仿萃取液,31P{1H}谱检测结果（图5的OANE3P）与标准溶液模拟样品SOANP的结果相似,信号强度和去干扰效果显著好于直接衍生原始有机液样品（OANP）。由于测试样品的基质不同, OANE3P和OANP的谱峰位移略有偏差。通过先后标准加入对应的高纯度的磷酰化合成产物,完成了定性鉴定。

图4 含0.5％柴油的正己烷溶液中醇与CTMP原位衍生的31P{1H}NMR谱：（A）醇浓度50μg/mL,累加800次；（B）醇浓度10μg/mL,累加30000次；（C）空白基质,累加30000次；2-（N,N-二丙氨基）乙醇1,2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇2,2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇3,频哪醇4Fig.431P{1H}NMR spectra of themixture of four alcohols in hexane contained 0.5％diesel fuelafter in situ phosphorylation with CTMP：（A）50μg/mL of alcohols,number of scans=800；（B）10μg/mL of alcohols, number of scans=30000；（C）blank matrix,number of scans=30000；1,2-（N,N-Dipropylamino）ethanol；2,2-（N-Butyl-N-ethylamino）ethanol；3,2-（N-Isopropyl-N-propylamino）ethanol；4,pinacol

图5 31P{1H}NMR谱：（A）直接原位磷酰化衍生0.5 mL有机液样品（子样编号：OANP）；（B）2 mL有机液样品先用重水萃取,再用氘代氯仿反萃取重水溶液,最后原位磷酰化衍生氘代氯仿萃取液（子样编号：OANE3P）；（C）原位磷酰化衍生2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-异丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇的混合标准溶液（子样编号：SOANP）Fig.531P{1H}NMR spectra：（A）direct in situ phosphorylation of 0.5 mL of original organic sample （aliquot code：OANP）；（B）2 m L of organic sample was extracted with D2O firstly,then the D2O extractwas extracted with CDCl3,at last in situ phosphorylation of the CDCl3extract（aliquot code：OANE3P）；（C）in situ phosphorylation of the standard solution of themixture of2-（N,N-Dipropylamino）ethanol,2-（N-Isopropyl-N-propylamino）ethanol and 2-（N-Butyl-N-ethylamino）ethanol（aliquot code：SOANP）

4 结论

以2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环为衍生试剂,氘代氯仿为溶剂,在核磁管内原位衍生醇类化合物测定磷谱的分析方法,反应专一、产物稳定、磷谱分辨率高,且操作简便,成功应用于OPCW官方水平考试有机液样品中氨基醇化合物同分异构体的检测鉴定。本研究表明,针对目前大多数核磁仪器缺乏在线色谱分离、检测灵敏度低于其他光谱检测器、灵敏度最高的核磁氢谱容易受到背景物质干扰的缺点,采用原位衍生转换检测核,不仅可以有效解决干扰,同时还能将样品制备过程简化。在转换检测核的选择上,不仅要考虑谱峰分辨率和基质背景干扰的问题,还要考虑检测灵敏度,因此,除了磷衍生化,还可氟衍生转化为同样具有高灵敏度和高分辨的氟核检测；在转换检测核的样品处理上,操作越简单、转换效率越高越有利于方法的应用。通过开展适用于核磁检测的衍生化试剂和反应条件的研究,将有利于进一步发挥核磁技术在无损检测复杂样品中的作用。

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25 Work Instruction for the Preparation of Samples for OPCW Proficiency Tests,QDOC/LAB/WI/PT02（6th August2012）

26 Preliminary Evaluation of the Results：Thirty-Second Official Proficiency Test；Technical Secretariat of the Organization for the Prohibition of ChemicalWeapons（January 2013）Vol.Ⅱ.

（Received 5 April2015；accepted 20 July 2015）

In Situ Phosphitylation for Nuclear M agnetic Resonance Identification of Precursors of Chem icalW arfare Agents

HUANG Gui-Lan*,YUAN Ling,LIU Shi-Lei,ZHOU Shi-Kun
（State key Laboratory ofNBC Protection for Civilian,Research Institute ofChemical Defence,Beijing 102205,China）

There is a trouble for1H NMR identification of non-phosphorus precursors of chemical warfare agents listed in Schedule 2,part B of Chemical Weapons Convention（CWC）in complex matrix.Analternativemethod was proposed for identification by in situ derivatization of the precursors containing hydroxyl functionswith 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane（CTMP）in a NMR tube followed by phosphorus-31 NMR detection.The specificity,stability,sensitivity and selectivity of the method were evaluated with pinacol and three aminoalcohols isomers,2-（N,N-dipropylamino）ethanol,2-（N-butyl-N-ethylamino）ethanol and 2-（N-isopropyl-N-propylamino）ethanol.The results showed that the phosphorylation productswere single,stable and allowing clear distinction between aminoalcohols isomers.The method was used for the detection and identification of threemixed aminoalcohols isomers present（atoriginal concentration of 10μg/mL）in an organic sample from 32thOPCW Official Proficiency Tests.

Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance；In situ derivatization；Non-phosphorus precursors；Chemical warfare agents；Aminoalcohols；Phosphitylation

10.11895/j.issn.0253-3820.150178

2015-04-05收稿；2015-07-20接受