Plackett-Burman 联合星点设计优选甜瓜蒂中葫芦素的提取工艺

郭梦鸿， 孙玉琦 ， 刘 影， 颜冬雪， 沈丽萍

(辽宁医学院，辽宁 锦州121001)

甜瓜蒂为葫芦科植物甜瓜Cucumis melo L. 的干燥成熟果蒂，别名瓜蒂、苦丁香、瓜丁等。具有涌吐痰食、除湿退黄、保肝抗癌之功效。甜瓜蒂中含有一系列高度氧化的四环三萜类化合物——葫芦素成分，包括葫芦素B、E、D，异葫芦素B，葫芦素B 葡萄糖苷等［1］。葫芦素类成分具有多种潜在药理作用［2-3］，广泛用于抗炎和抗癌研究。其中，葫芦素B 为其主要活性成分，具有保肝抗癌、影响细胞间信号转导、增强毛细血管通透性、改善微循环等功效［4-5］。研究表明，葫芦素B 具有确切的抗肿瘤作用，可用于肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等［6-10］多种肿瘤疾病，并且其抗癌作用具有生物功能选择性［11］。

Plackett-Burman 设计可通过较少次数实验从众多因素中筛选主要影响因素，从而避免在后期优化时由于部分因子影响不显著而浪费资源［12］。星点设计(CCD)-响应面法(RSM)［13］可研究变量间相互作用，是一种多元非线性拟合的设计方法。通过描绘因素的响应面及叠加等高线图，能够在设定的实验区域内，找到一个明确的函数式来表达各因素与响应值之间的关系，从而找到整个区域中考察因素的最佳组合和响应的最优值［14］。本研究基于Plackett-Burman 实验设计，筛选影响提取效果的主要因素，结合星点设计-响应面法，优选甜瓜蒂中葫芦素的提取工艺，并验证方法的可行性，为甜瓜蒂中葫芦素成分的开发利用提供基础依据。

1 仪器与材料

UV-2550 型UV-Vis 分光光度计(日本岛津公司);L-2000 Elite 高效液相色谱仪，配有L-2130高压恒流泵，L-2455 DAD 检测器，D-2000 Elite 色谱数据处理工作站(日本日立公司);RE-52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

葫芦素B 对照品(中国食品药品检定研究院，批号111945-201301，纯度96.9%)。甜瓜蒂(产地河北省保定市)。色谱纯甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);香草醛(上海瀚思化工有限公司);冰醋酸、浓硫酸、甲醇、无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 UV-Vis 分光光度法测定总葫芦素

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取葫芦素B 对照品10.0 mg，置50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得葫芦素B 对照品溶液(0.2 mg/mL)。

2.1.2 标准曲线的建立 取不同体积葫芦素B 对照品溶液分别置10 mL 量瓶中，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液2.0 mL、浓硫酸1.0 mL，70 ℃恒温反应30 min，冰醋酸定容，摇匀，543 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标(A1)，葫芦素B 质量浓度为横坐标(C1)，得回归方程A1=21.163C1+0.097 6 (r = 0.999 6)，葫芦素B 在4.0 ～64.0 μg/mL 范围内呈良好线性关系。

2.1.3 精密度试验 精密量取葫芦素B 对照品溶液0.8 mL 于10 mL 量瓶中，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，连续测定6 次，计算RSD 值为0.93%。结果表明仪器的精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 精密量取葫芦素B 对照品溶液0.8 mL 于10 mL 量瓶中，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，测定时间为60 min，时间间隔为10 min。结果显示在60 min 内吸光度的RSD 为4.96%，而在10 ～30 min 内的RSD 为1.05%，表明该方法在30 min 内稳定，超过30 min 后稳定性下降。

2.1.5 加样回收率试验 精密吸取成分含有量已知供试品溶液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，平行9 份，分别加入低、中、高质量浓度葫芦素B 对照品溶液，按“2.1.2”项下方法测定吸光度。平均回收率为99.57%，RSD 为1.26%。

2.2 HPLC 法测定葫芦素B［15］

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-水(61 ∶39);检测波长228 nm;体积流量1.0 mL/min;进样量20 μL。

2.2.2 方法学考察［15］按“2.2.1”项下色谱条件，分别对线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率进行考察，得回归方程A2=47 622C2-39 234 (r = 0.999 6)，线性范围4.0 ～64.0 μg/mL，精密度、稳定性、重复性、加样回收率结果如表1。

表1 方法学考察结果Tab.1 Result of methodological study

结果表明精密度良好，供试品溶液在24 h 内稳定，且方法重复性较好，加样回收率结果符合定量测定要求。

2.3 样品制备与测定 取甜瓜蒂药材粗粉约20.0 g，精密称定，置于250 mL 圆底烧瓶中，加入一定量不同体积分数乙醇，分次提取，过滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得干燥粉末，称定质量。精密称取干燥粉末50.0 mg 置10 mL 量瓶中，甲醇溶解、定容，得供试品溶液。精密量取供试品溶液0.1 mL，置10 mL 量瓶中，按“2.1.2”项下方法制备样品，于543 nm 处测定吸光度，根据回归方程计算总葫芦素含有量(以葫芦素B 计)。另取供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行检测，计算葫芦素B 含有量。总葫芦素提取率(%) =提取物质量/药材质量×100%。

2.4 Plackett-Burman 实验设计筛选主要影响因素

2.4.1 Plackett-Burman 实验设计及结果 选用Plackett-Burman 设计对甜瓜蒂中葫芦素成分提取工艺影响因素的显著性进行考察。实验设计5 个因素(A 乙醇体积分数，B 料液比，C 提取时间，D 提取次数，E 提取温度)，6 个空白因素(F，G，H，I，J，K)。根据单因素考察结果确定每个因素高、低两种水平(+1，-1)，以总葫芦素含有量、葫芦素B 含有量、总葫芦素提取率为响应值。Plackett-Burman 实验设计因素及水平见表2，结果见表3。

表2 Plackett-Burman 设计因素及水平Tab.2 Factors and levels of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 设计结果Tab.3 Result of Plackett-Burman design

2.4.2 分析与结论 采用Design-Expert 8.0 软件对各因素进行显著性分析，通过Pareto 图［16］判定各因素显著性，每个因素效应的大小由条形图所占比例表示，各因素显著性分析结果见图1。

图1 响应值的Pareto 图Fig.1 Pareto charts of response values

通过以上结果可知，影响因素中乙醇体积分数、时间、温度、次数对响应值有交叉性影响，其中提取次数对葫芦素B 含有量和总葫芦素提取率表现出显著性则选择提取3 次，而料液比对各响应值均不具有显著性，结合实际意义选择料液比为1 ∶8。由此，确定乙醇体积分数、时间、温度作为显著性影响因素。

2.5 星点设计-效应面优化实验

2.5.1 星点设计-效应面实验设计及结果 根据Plackett-Burman 实验结果结合星点设计-响应面原理，以乙醇体积分数 (X1)、时间 (X2)、温度(X3)为考察因素，总葫芦素含有量(Y1)、葫芦素B 含有量(Y2)、总葫芦素提取率(Y3)为响应值进行优化实验。分析因素及水平见表4，实验设计方案与结果见表5。

表4 星点设计因素及水平Tab.4 Factors and levels of CCD

2.5.2 工艺优化与预测 应用Design-Expert 8.0实验设计软件，分别绘制三维效应面图(图2)。

采用效应面等高线叠加法对葫芦素成分提取工艺进行优化，先固定总葫芦素及葫芦素B 含有量模型中次要因素X3，考察显著因素X1、X2对Y1、Y2、Y3的交互影响，再固定总葫芦素提取率模型中次要因素X2，考察显著因素X1、X3对Y1、Y2、Y3的交互影响，分别绘制叠加等高线图，确定提取条件的最优化区域(图3)，结合以上三维效应面图，优化得到最佳工艺为乙醇体积分数98.95%，提取时间 77.84 min，提取温度75.95 ℃。此条件下，各响应值的预测理论值分别为总葫芦素20.57%，葫芦素B 13.69%，总葫芦素提取率11.93%。考虑到实验的可操作性，最终确定提取条件为乙醇为无水乙醇，时间90 min，温度75 ℃。

表5 星点设计实验结果Tab.5 Result of CCD

图2 各响应值三维效应面图Fig.2 3D analysis charts of response values

图3 优化模型等高线叠加图Fig.3 Overlapping figures of the contour plots of optimum model

2.5.3 提取工艺验证 为了确定模型预测与实验结果一致性进行验证试验。提取工艺为8 倍量无水乙醇，75 ℃提取3 次，90 min/次，平行3 次，取平均值，计算偏差率［偏差率= (真实值-预测值)/预测值× 100%］。实验结果见表6。

表6 葫芦素类成分提取工艺验证结果(n=3)Tab.6 Result of verification test for cucurbitacins extraction technology (n=3)

3 讨论

为了保证实验的精度，缩小Plackett-Burman实验设计各因素范围，前期实验中，以总葫芦素含有量、葫芦素B 含有量及总葫芦素提取率为指标，对影响因素(提取溶剂、提取溶剂浓度、料液比、提取时间、提取次数、提取温度)进行了单因素考察，确定乙醇为提取溶剂较好，同时明确了各影响因素的试验范围。

实验中采用Plackett-Burman 实验设计联合星点设计-效应面法优化甜瓜蒂中葫芦素成分的提取工艺，可以评价因素与响应值间的非线性关系，使精确度更高、指导性更强。Pareto 图筛选显著因素更加直观，操作简便易于理解，利于实验的显著性分析。对星点设计-效应面实验的数据进行多元回归拟合，由二次多元回归方程可知，P 值均为P ＜0.000 1，表明模型显著;且模型相关系数R2值均较大，说明可信度良好，方程与实际情况拟合较好。同时，通过方差分析，确定各响应值的主要影响因素，利于等高线叠加分析［17］。该分析方法，可实现成分含有量与提取率的同步优化，实验中对多个指标考察，形成多因素综合评价，得到具有实际应用价值的葫芦素成分提取的工艺参数。

验证结果表明，实验中所建立的数学模型具有较佳的预测性，实验设计有较高的可靠性，为葫芦素类成分的分离纯化提供了实验基础。

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