RP-HPLC 法同时测定金银花中10 种化学成分

王春秋， 李雯霞

(河南省洛阳正骨医院 河南省骨科医院，河南 洛阳471002)

金银花又名忍冬，为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或初开的花，其性寒，味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风等功效［1-3］。现代药理研究表明，金银花有着抗炎、解热、增强免疫、抗菌、兴奋中枢、降血脂、抗内毒素等作用［4-7］。《中国药典》2010 版以绿原酸和木犀草苷为金银花质量控制的指标，但此两者均不能全面代表其质量和功效。金银花含有机酸、黄酮、皂苷及鞣质等化学成分，目前的测定方法主要有HPLC 法、紫外分光光度法、近红外光谱法、毛细管电泳法等［8-11］，但毛细管电泳法和近红外光谱法所需仪器的价格较昂贵，紫外分光光度法测得结果的准确度较差，而HPLC 法操作简单、结果准确、效率较高、应用较广，可作为同时测定多种化学成分的方法，并能简化繁琐的实验过程。但是，目前金银花药材中所测定的化学成分较为单一，尚无同时测得多种成分的报道。本实验用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)同时测定该植物中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量，用来建立完善的金银花质量控制方法。

1 仪器、试药和材料

Waters 2695 HPLC 色谱仪，包括2998 紫外检测器、四元梯度泵、柱温箱、自动进样器(美国Waters 公司);KQ-100 超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Sartorius BP211D 分析天平(德国赛多利斯集团)。绿原酸(批号110753-200413)、芦丁 (批号100080-200707)、木犀草苷 (批号111720-201106)、槲皮素(批号100081-200907)、咖啡酸(批号110885-200102)对照品(中国药品生物制品检定所);新绿原酸 (批号 MUST-10091501)、隐绿原酸(批号905997)、异绿原酸A (批号A0025)、异绿原酸B (批号071130)、异绿原酸C (批号MUST-09041001)对照品(成都曼思特生物科技有限公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯(迪马科技有限公司);其他试剂均为分析纯;水为超纯水(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性试验 Agilent C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-0.2% 磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0 ～15 min，10%～20% A;15 ～40 min，20%～30% A;40 ～60 min，30% ～55% A);柱温30 ℃;体积流量1.0 mL/min;检测波长350 nm。理论塔板数按绿原酸峰计算，不低于2 000，HPLC 结果见图1。

图1 混合对照品和供试品的HPLC 图Fig.1 HPLC of hybrid reference substances and test samples

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 对照品适量，置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，配制成相应的贮备液。然后，精密吸取各贮备液适量，置于25 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解，稀释至刻度，即得混合对照品溶液(每1 mL 溶液中分别含有新绿原酸0.114 mg、绿原酸0.794 mg、隐绿原酸0.051 mg、咖啡酸0.013 mg、芦丁0.015 mg、木犀草苷0.008 mg、槲皮素0.013 mg、异绿原酸B 0.023 mg、异绿原酸A 0.215 mg、异绿原酸C 0.351 mg)。

2.3 供试品溶液的制备 取金银花粉末适量，过3 号筛，精密称取0.2 g，加入50% 甲醇10 mL，超声处理(250 W、50 kHz)20 min，放冷，50%甲醇补足减少质量，摇匀，0.45 μm 滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系试验 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入色谱仪，以进样量(μg)为自变量(x)，色谱峰面积为因变量(y)，绘制标准曲线，建立回归方程。结果发现，该方法在较大范围内的线性关系良好，见表1。

表1 金银花中10 种成分的回归分析结果Tab.1 Result of the regression analysis of 10 chemical constituents in Lonicera japonica Thunb

2.5 仪器精密度 精密吸取混合对照品溶液10 μL，计算峰面积RSD。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的RSD 分别为1.8%、0.6%、0.8%、2.0%、1.6%、2.2%、1.9%、2.6%、2.7%、2.8%，表明仪器精密度良好。

2.6 方法稳定性 精密吸取“2.3”项下同一供试品溶液20 μL，分别于0、1、2、3、4、6、8、12，24 h进样，计算峰面积RSD。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的RSD 分别为1.4%、0.4%、1.0%、1.8%、1.8%、2.5%、2.1%、2.1%、2.9%、2.6%，表明该方法稳定性良好。

2.7 方法重复性 取同一批样品，共6 份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样体积20 μL，以峰面积外标法计算其含有量。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量分别为1.59、28.48、0.64、0.22、0.19、0.09、0.15、0.28、7.43、2.67 mg/g，RSD分别为 1.4%、1.3%、1.1%、1.3%、0.6%、1.7%、1.8%、2.3%、2.3%、2.7%，表明该方法重复性良好。

2.8 方法回收率 精密称取已测定含有量的样品(产地江苏南通)6 份，每份0.1 g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量。然后，精密加入混合对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下测定，计算回收率。结果，各成分的回收率分别为 97.9%、100.2%、102.9%、99.7%、103.1%、100.7%、101.1%、99.5%、100.8%、102.2%，见表2，表明该方法回收率良好。

表2 金银花中10 种成分的加样回收率试验结果Tab.2 Result of recovery tests of 10 chemical constituents in Lonicera japonica Thunb

续表2

2.9 样品测定 取10 个不同产地的金银花药材适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，然后以外标两点法计算各成分的含有量，结果见表3。

3 讨论

本实验采用RP-HPLC 法，同时对金银花中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 进行含有量测定和相应的方法学考察。例如，金银花中这些化学成分的最大吸收波长均在350 nm 左右，因此本实验选择350 nm 作为检测波长。同时，还研究了不同系统的流动相，包括乙腈-水和甲醇-水溶液，发现当以乙腈-水溶液为流动相时，色谱峰的峰型和分离度均良好，而且保留时间理想，故选择其作为流动相。另外，本实验所采用梯度洗脱的比例变化和步骤较小，克服了传统洗脱因其复杂性所导致的重复性较低和基线不稳等问题，但随后注意到，在该流动相系统中，各峰形情况不佳，对称因子未全部达到要求，故又考察了流动相pH 对实验的影响。结果显示，随着磷酸浓度的加大(0.1%、0.2%、0.3%)，峰形越来越理想，其中在0.2%磷酸水溶液条件下的分离效果最好，而且各峰的对称因子均在0.95 ～1.05 之间，因此确定乙腈-0.2%磷酸水溶液系统为流动相。

研究表明［12-14］，不同产地金银花中各化学成分的差异较大，这与本实验结果一致，并发现新绿原酸的含有量差异最大。郝江波等［15］报道，加工和贮藏过程对金银花的化学成分具有较大影响，表现在成分的种类和含有量上，而本实验10 个不同来源金银花药材中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的含有量差异均较大，可能与其产地、加工、贮藏等因素有关。由此表明，在对金银花质量进行控制时，不应仅把其中的单一成分作为控制指标，并且需注意加工和贮藏条件。本实验对金银花中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 这10 个化学成分进行检测，可为其质量评价标准提供科学依据。

表3 不同产地金银花中10 种成分的分析结果(n=3，mg/g)Tab.3 Analysis result of 10 chemical constituents in Lonicera japonica Thunb from different growing areas (n=3，mg/g)

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