香菇多糖对部分肝切除老年小鼠术后炎症反应及认知功能的影响

刘 彩， 白银亮， 贺东强

(1. 兰州大学第二医院药学部，甘肃 兰州730030;2. 兰州大学第二医院VIP 外科，甘肃 兰州730030)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年患者术后常见的中枢神经系统并发症，主要临床表现为术后学习、记忆及定向等认知功能障碍［1］。迄今为止，POCD 的确切发病机制尚不清楚。既往研究报道动物术后早期的认知功能障碍主要与术后外周和中枢海马炎症因子过度释放有关，而且针对炎症反应的治疗措施能够预防和减轻术后早期的认知功能障碍［2］。

香菇多糖(lentinan)是香菇子实体细胞壁的结构成分，是香菇的主要药理活性成分之一［3］，具有抑制急慢性炎症反应作用［4-5］。目前，香菇多糖作为免疫调节剂已广泛应用于临床，但其对术后炎症反应和认知障碍的作用至今尚未见报道。本实验拟建立老年小鼠肝叶部分切除术模型，评价香菇多糖对术后炎症反应及认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性ICR 小鼠，鼠龄12 月，体质量30 ～34 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号HNASLKJ20130513。

1.2 药物及试剂 香菇多糖粉针(1 mg，批号130202，南京绿叶思科制药有限公司)。兔源抗TNF-α、IL-1β、IL-6抗体(Abcam 公司);HRP 结合的羊抗兔二抗(Jackson 公司);TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒 (R＆D 公司);BCA 蛋白定量试剂盒、RIPA 裂解液(碧云天生物技术有限公司);蛋白酶抑制剂混合片(Roche 公司)。

1.3 实验仪器 Morris 水迷宫(上海移数信息科技有限公司);全波长酶标仪(美国Thermo 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立及分组 实验分正常对照组、假手术组、手术组、香菇多糖组。根据文献方法建立老年小鼠肝叶部分切除术模型［6］。10% 水合氯醛腹腔注射(4 mL/kg )麻醉，待翻正反射消失后固定，消毒并于剑突下腹部正中切开约2.0 cm 切口，打开腹腔并分离肝脏左侧叶，在远端蒂部7 号丝线结扎后切除结扎外侧的肝脏组织，止血后逐层关腹。假手术组麻醉后于腹部相同部位做切开缝合术。根据文献［5］，选用香菇多糖灌胃剂量为20 mg/kg。香菇多糖组于术前7 d 开始直至术后第2 天灌服香菇多糖，每天1次。假手术组和手术组灌服同体积的生理盐水。

1.4.2 Morris 水迷宫测试 术前6 d 进行水迷宫训练，每只动物每天训练4 次。每次将动物面向池壁放入水中，让其寻找到水中的平台(置于第Ⅰ象限水面下1 cm 处)，所耗时间记为潜伏期。设定寻找平台的最大时限为60 s (即在60 s 内未找到平台者停止记录，并将潜伏期记为60 s)。撤去水中平台，选取原平台正对象限(第Ⅲ象限)为入水点，并将动物面向池壁放入水中，动物自由游泳60 s，记录60 s 内动物穿过平台区的次数。选取最后4 次测试结果的平均值为手术前成绩。手术后第2 天分别进行上述测试并记录潜伏期和穿台次数。

1.4.3 ELISA 检测 Morris 水迷宫测试结束后，水合氯醛麻醉小鼠，经眼眶采血约1 mL，室温静置2 h 后，离心收集血清，-20 ℃保存备用。采用酶联免疫吸附法检测TNFα、IL-1β 和IL-6 的表达，操作均按试剂盒说明书完成。

1.4.4 Western blot 检测 参考文献［2］方法，断头处死小鼠，于冰上快速分离双侧海马，液氮冷冻后移至-80 ℃冰箱中保存备用。标本称定质量后按照质量∶体积(mg/μL)为1 ∶9加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液中于冰上匀浆15 min，4 ℃、12 000 r/min 离心并提取上清。采用BCA 法对所提蛋白进行定量，规定上样总蛋白量为40 μg。按1 ∶4 加入5 ×SDS 上样缓冲液沸水浴中5 min，10%SDS-PAGE胶电泳转膜各2 h。经5%脱脂奶粉封闭1 h 后，TBST 洗膜3 × 10 min，加人一抗TNF-α、IL-1β、IL-6 抗体 (1 ∶2 000)，4 ℃过夜。用TBST 洗膜后加入二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h，漂洗后ECL 法显色，胶片扫描后使用Image pro plus 软件分析积分光密度值。

2 结果

2.1 香菇多糖对部分肝切除小鼠术后认知功能的影响 术前水迷宫潜伏期和穿台次数各组动物之间差异均没有统计学意义，表明香菇多糖对正常小鼠认知功能无明显影响。术后假手术组与正常对照组相比，潜伏期略有延长，穿台次数略有减少，但差异没有统计学意义。与假手术组相比，手术组潜伏期显著性延长(P ＜0.01)，穿台次数明显减少(P ＜0.01)。香菇多糖能够有效抑制肝切除术诱导的小鼠术后潜伏期延长(P ＜0.05)和穿台次数减少(P ＜0.05)，见表1。

2.2 香菇多糖对部分肝切除小鼠术后外周血炎症细胞因子表达的影响 与正常对照组比较，假手术组、手术组和香菇多糖组外周血中TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平均明显升高(P 值均小于0.05)，手术组TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平明显高于假手术组(P 值均小于0.01)。与手术组比较，香菇多糖组TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平明显降低，可见香菇多糖能够有效抑制肝切除术诱导的小鼠术后外周血炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达，见表2。

表1 香菇多糖对部分肝切除老年小鼠术后认知功能的影响(±s，n=10)

表1 香菇多糖对部分肝切除老年小鼠术后认知功能的影响(±s，n=10)

注:与假手术组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与手术组比较，* P ＜0.05

组别潜伏期/s 穿台次数/次术前 术后 术前 术后正常对照组22.3 ±3.6 22.6 ±4.3 5.1 ±1.1 5.0 ±1.5假手术组 22.7 ±4.5 24.8 ±7.8 5.4 ±2.3 4.7 ±1.1手术组 21.9 ±4.7 34.1 ±6.2## 5.0 ±1.7 3.4 ±1.2##香菇多糖组 22.1 ±3.7 28.9 ±5.6#* 5.2 ±1.3 4.2 ±1.4#*

表2 香菇多糖对部分肝切除小鼠术后外周血炎症细胞因子表达的影响(±s，n=10)

表2 香菇多糖对部分肝切除小鼠术后外周血炎症细胞因子表达的影响(±s，n=10)

注:与假手术组比较，## P ＜0.01;与手术组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与正常对照组比较，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

组别TNF-α/(pg·mL -1)IL-1β/(pg·mL -1)IL-6/(pg·mL -1)6.4 ±1.2 7.6 ±3.2 5.3 ±1.6假手术组 10.8 ±4.6Δ 16.3 ±6.2Δ 17.6 ±8.2Δ手术组 36.2 ±9.3ΔΔ## 48.1 ±13.2ΔΔ## 46.5 ±12.8ΔΔ#香菇多糖组 13.8 ±7.2Δ* 21.5 ±9.6Δ＊＊ 21.9 ±10.6Δ*正常对照组

2.3 香菇多糖对部分肝切除小鼠术后海马组织炎症细胞因子表达的影响 术后假手术组与正常对照组相比，海马组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表达均没有统计学差异。与假手术组相比，手术组TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表达均显著性升高(P ＜0.05)，尤其是TNF-α 的表达。与手术组比较，香菇多糖组TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平明显降低(P ＜0.05)，表明香菇多糖能够有效抑制肝切除术诱导的小鼠术后海马组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 升高，见图1。

图1 香菇多糖对部分肝切除小鼠术后海马组织炎症细胞因子表达的影响(±s，n=10)

3 讨论

Morris 水迷宫测试已被广泛应用于啮齿类动物空间学习记忆功能的评价，其中潜伏期和穿台次数是最主要的评价指标［7］。本研究结果显示肝叶部分切除术后小鼠潜伏期延长，穿台次数减少，动物学习记忆能力下降，出现认知功能障碍。本研究结果显示香菇多糖能够有效改善肝叶部分切除术后小鼠的认知功能障碍，这属首次报道。

近年来，有关术后认知功能障碍的病因及机制的研究已成为神经科学研究的热点之一，但其机制迄今仍不确切［8］。众多动物实验结果表明，围术期手术操作所致的中枢和外周炎症反应与早期术后认知功能障碍发生密切相关，尤其是细胞炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的过度释放所引起的动物记忆长时程增强(long-term potentiation，LTP)抑制被认为是而导致动物认知功能损害进而发生术后认知功能障碍的重要机制［2，9-10］。研究发现围术期手术操作导致的组织损伤及应激反应能够激活机体固有免疫系统，进而触发炎症级联反应，导致细胞炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6等的过度释放［11］，而且针对围术期炎症反应的治疗措施对早期术后认知功能障碍具有明显的改善作用［2，12-13］。这就表明抑制细胞炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 等的过度释放对于预防和减轻术后早期的认知功能障碍至关重要。

研究显示外周炎症反应的激活及细胞炎症因子的释放能够明显影响中枢神经系统的功能［14］。本实验研究结果表明肝叶部分切除术引起小鼠外周血中TNF-α、IL-1β 和IL-6的大量释放，而香菇多糖对其具有明显的抑制效应。中枢神经炎症反应，尤其是海马炎症反应被认为是动物术后早期的认知功能障碍发生的关键机制［15］。多项研究表明干预围术期海马炎症因子的释放对改善早期的认知功能障碍至关重要［2，9，16］。本研究结果显示香菇多糖能够有效抑制肝切除术诱导的小鼠术后海马组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的过度释放。结合Morris 水迷宫测试结果，我们发现外周血和海马组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的过度释放和认知功能下降呈对应关系，因此认为香菇多糖改善肝叶部分切除术后小鼠的认知功能障与其抑制外周血和海马组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的过度释放密切相关。

综上所述，香菇多糖能够有效改善部分肝切除老年小鼠术后认知功能障碍，其机制与抑制外周血和海马组织中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达有关。本研究无疑将为香菇多糖的临床应用提供一种新的思路。

［1］ Grape S，Ravussin P，Rossi A，et al. Postoperative cognitive dysfunction［J］. Trends Anaesthesia Critical Care，2012，2(3):98-103.

［2］ Chu Q J，He L，Zhang W，et al. Hydrogen sulfide attenuates surgical trauma-induced inflammatory response and cognitive deficits in mice［J］. J Surg Res，2013，183(1):330-336.

［3］ Zhang Y Y，Li S，Wang X H，et al. Advances in Lentinan:isolation，structure，chain conformation and bioactivities［J］.Food Hydrocolloid，2011，25(2):196-206.

［4］ 王 蕾，曹高忠，叶乐平，等. 香菇多糖对哮喘大鼠模型气管炎性反应及辅助性T 淋巴细胞1/辅助性T 淋巴细胞2 免疫应答失衡的调节［J］. 实用儿科临床杂志，2007，22(21):1630-1631.

［5］ 欧阳学农，余宗阳，王文武，等. 香菇多糖抗炎作用的实验研究［J］. 军医进修学院学报，2006，27(1):56-57.

［6］ Wan Y，Xu J，Meng F，et al. Cognitive decline following major surgery is associated with gliosis，β-amyloid accumulation，and T phosphorylation in old mice［J］. Crit Care Med，2010，38(11):2190-2195.

［7］ Vorhees C V，Williams M T. Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nature Protocols，2006，1(2):848-858.

［8］ Rundshagen I. Postoperative cognitive dysfunction［J］. Deutsches Ärzteblatt Int，2014，111(8):119-125.

［9］ Wan Y，Xu J，Ma D，et al. Postoperative impairment of cognitive function in rats:a possible role for cytokine-mediated inflammation in the hippocampus［J］. Anesthesiology，2007，106(3):436-441.

［10］ Cibelli M，Fidalgo A R，Terrando N，et al. Role of interleukin-1β in postoperative cognitive dysfunction［J］. Ann Neurol，2010，68(3):360-368.

［11］ Tanaka S，Ide M，Shibutani T，et al. Lipopolysaccharide-induced microglial activation induces learning and memory deficits without neuronal cell deathin rats［J］. J Neurosci Res，2006，83(4):557-566.

［12］ Fidalgo A R，Cibelli M，White J，et al. Systemic inflammation enhances surgery-induced cognitive dysfunction in mice［J］.Neurosci Lett，2011，498(1):63-66.

［13］ Hudetz J A，Gandhi S D，Iqbal Z，et al. Elevated postoperative inflammatory biomarkers are associated with short-and mediumterm cognitive dysfunction after coronary artery surgery［J］. J Anesth，2011，25(1):1-9.

［14］ 董 涛. 术后认知功能障碍发病机制的研究进展［J］. 医学综述，2011，17(15):2334-2336.

［15］ Cao X Z，Ma H，Wang J K，et al. Postoperative cognitive deficits and neuroinflammation in the hippocampus triggered by surgical trauma are exacerbated in aged rats［J］. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2010，34(8):1426-1432.

［16］ Terrando N，Monaco C，Ma D，et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(47):20518-20522.