胶艾汤对子宫出血模型大鼠止血作用有效部位的筛选

贾 梅， 郑传柱， 李 慧， 张 丽 ， 丁安伟

(南京中医药大学，江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023)

胶艾汤出自东汉张仲景《金匮要略》［1］，全方由阿胶、艾叶、甘草、当归、川芎、白芍、生地黄七味组成。《金匮要略心典》云:“妇人经水淋漓，及胎前产后下血不止者，皆冲任脉虚，而阴气不能守也。是惟胶艾汤能补而固之”，胶艾汤临床主要用于治疗妇人月水过多、淋漓不止、或伴产后下血不绝、或妊娠下血、腹中疼痛等症。本实验室前期研究已表明胶艾汤具有较好的止血作用，胶艾汤中的阿胶、艾叶为胶艾汤发挥止血作用的主要药味［2-3］，但迄今为止，胶艾汤止血作用物质基础方面的报道较少。因此，本实验拟采用子宫出血模型大鼠筛选胶艾汤止血作用的有效部位，为深入研究胶艾汤止血作用的物质基础提供依据。

1 实验材料

1.1 实验药材 当归、川芎、白芍、生地、艾叶、甘草饮片均购于安徽丰源铜陵中药饮片有限公司，批号分别为121203，121203，121106，120908，121106，120908。阿胶购于山东福胶集团东阿镇阿胶有限公司，批号为120612。上述各饮片经南京中医药大学段金廒教授鉴定分别为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels. 的干燥根、伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根茎、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根、玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块根、菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant. 的干燥叶、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根茎和马科动物驴Equus asinus L. 的鲜皮经加工而成。

1.2 仪器与试药 LG-PABER-1 半自动凝血分析仪(北京世帝科学仪器有限责任公司);Anke-LXJ-11B 离心机(上海安寿科学仪器厂);SHANGPINGYP601N 型1/10 电子天平(上海精密科学仪器有限公司);紫外/可见分光光度计(PerkinElmer);MKIII 型酶标仪(Thermo fisher)。

米非司酮片 (浙江仙琚制药股份有限公司，批号111101);米索前列醇(Piramal Healthcare UK Limited，批号B03099);宫血宁胶囊(云南白药集团股份有限公司，批号ZK12009);枸橼酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号F20110506);水合氯醛 (Kermel，批号B1420001);羧甲基纤维素钠(上海久亿，批号20090910)。NaCl (西陇化工股份有限公司，批号1109241);甲醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20130325);硅藻土(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20090710);石油醚 (60 ～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇均为国产分析纯。试剂盒包括凝血酶原时间 (PT，批号STG20101-49)、凝血酶时间(TT，批号STG20301-35A)、活化部分凝血活酶时间(APTT，批号ST20201-41)、血浆纤维蛋白原(FIB，批号STY20401-42)，二磷酸腺苷(ADP 粉剂1 瓶，ADP 缓冲液10 mL/瓶)均购于北京世帝科学仪器公司;血栓烷素B2(TXB2，批号1025RT01)、6-酮-前列腺素 (6-keto-PGFla，批号1024RW08)、雌二醇(E2，批号1022XG06)、孕酮(P，批号1020VH11)、促黄体生成激素 (LH，批号1023AO09)、卵泡刺激素(FSH，批号1025QU15)均购于北京北方生物技术研究所。

1.3 实验动物 雌性SD 大鼠80 只，SPF 级，体质量220 ～250 g;雄性SD 大鼠40 只，SPF 级，体质量250 ～300 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK (浙)2014-0001。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备 称取胶艾汤组方饮片2 880 g(阿胶∶川芎∶甘草∶艾叶∶当归∶白芍∶生地黄2 ∶2 ∶2 ∶3 ∶3 ∶4 ∶4)，依古法加水煎煮［1］，水煎液减压浓缩得到胶艾汤浸膏，取胶艾汤浸膏适量减压真空干燥，得胶艾汤干燥粉末，保存备用。剩余浸膏趁热用硅藻土拌样(硅藻土与浸膏比例为1 ∶1.5)后置减压真空干燥箱55 ℃烘干。再采用系统溶剂提取法对胶艾汤干燥药粉进行提取，各溶剂提取物减压真空干燥至干，得石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏、水部位浸膏分别为6.5 g(得率0.23%)、40.2 g (得率1.40%)、268.8 g (得率9.30%)、492.0 g (得率17.08%)。分别称取适量的胶艾汤及4 个提取部位浸膏，加0.5%CMC-Na 溶液适量，制得质量浓度 (按生药量计算)分别为1.20、1.20、1.20、1.20、1.20 g/mL 的各供试品溶液。另取宫血宁胶囊适量，加0.5%CMC-Na 溶液制成质量浓度为15.60 mg/mL 宫血宁溶液，各供试品溶液置4 ℃冰箱内保存备用。

2.2 动物分组及给药 将子宫出血模型复制成功的雌性大鼠按照随机数字表法随机分为8 组，每组10 只，分别为空白组，模型组，宫血宁组，胶艾汤组，石油醚组，乙酸乙酯组，正丁醇组，水组。各给药组均按照临床给药剂量2倍折算成动物给药剂量，即宫血宁组0.156 g/(kg·d)、胶艾汤组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组、水组均为12 g/(kg·d)(按生药量计算)。各给药组于妊娠第8 天按1 mL/100 g 给药量灌胃相应药物，空白组与模型组灌胃等剂量的0.5%CMC-Na 溶液，每天给药1 次，连续给药7 d。

2.3 子宫出血模型复制 于17 ∶00 将大鼠按雌雄2 ∶1 比例合笼，次日8 ∶00 进行阴道涂片检查，以发现精子为妊娠第1 天。于第7 天分别灌胃米非司酮8.3 mg/kg (8 ∶00)和米索前列醇100 μg/kg (18 ∶00)，复制早孕大鼠子宫出血模型［4］，灌胃完米索前列醇后于阴道内置入定量棉球一个，于次日8 点和18 点将定量棉球取出并置入新棉球，以观察到棉球出血表示子宫出血模型复制成功。

2.4 指标检测 第7 天灌胃米索前列醇后于阴道内置入定量棉球(棉球质量85 ～90 mg)一个(定量棉球用塑料薄膜半包裹，以防血液外漏和尿液返流)，分别于次日8 点和18 点将定量棉球取出并置入新棉球，取出的棉球置于自封袋内于4 ℃冰箱内保存(用于子宫出血量测定)，持续至第14 天，记录各组动物子宫出血时间 (uterine bleeding time，UBT)，依文献［4］ 方法计算子宫出血量(uterine bleeding quantity，UBQ)。

于第14 天各给药组给药40 min 后，动物以10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，以3.8%枸橼酸钠抗凝体积比(1 ∶9)，全血以3 000 r/min 离心10 min，取上层贫血小板血浆(PPP)用半自动凝血分析仪按照凝血四项说明书测定凝血四项，另取全血2 mL (不加抗凝剂)静置30 min 后以3 000 r/min 离心10 min，取上层血清用96 孔板按照ELISA 试剂盒说明书测定血清中TXB2、6-keto-PGFla、E2、P、LH、FSH 的水平。

大鼠处死后，迅速摘取子宫，置10%福尔马林中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，做组织形态学检查。

2.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行双样本t 检验及方差分析，所有实验数据均采用(±s)表示，以P ＜0.05 或P ＜0.01 具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 对子宫出血模型大鼠E2、P、LH、FSH 的影响 与空白组比较，模型组大鼠E2、P、LH、FSH 明显降低(P ＜0.01)。与模型组比较，宫血宁组、胶艾汤组可明显升高FSH (P ＜0.01)、LH (P ＜0.01，P ＜0.05)、P (P ＜0.01，P ＜0.05)、E2 (P ＜0.05，P ＜0.01);乙酸乙酯组可明显升高E2、P、LH、FSH (P ＜0.01);正丁醇组可明显升高LH (P ＜0.01);水组可明显升高E2、FSH (P ＜0.05)。实验结果见表1。

表1 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠E2、P、LH、FSH 的影响(±s，n=10)

表1 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠E2、P、LH、FSH 的影响(±s，n=10)

注:与空白组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01，下表同

组别 剂量/(g·kg -1) E2/(pg·mL -1) P/(ng·mL -1) LH/(mIU·mL -1) FSH/(mIU·mL -1)空白组 - 365.43 ±17.65 6.33 ±0.29 18.72 ±0.83 4.39 ±0.30模型组 - 299.21 ±38.31＊＊ 5.66 ±0.40＊＊ 12.01 ±0.48＊＊ 3.74 ±0.35＊＊宫血宁组 0.156 336.94 ±14.55# 6.31 ±0.26## 15.37 ±0.83## 4.40 ±0.44##胶艾汤组 12 369.97 ±13.83## 6.07 ±0.22# 13.10 ±1.09# 4.30 ±0.22##石油醚组 12 311.27 ±22.67 5.88 ±0.41 12.51 ±0.65 4.16 ±0.61乙酸乙酯组 12 350.61 ±17.92## 6.40 ±0.21## 15.65 ±1.44## 4.38 ±0.19##正丁醇组 12 323.46 ±30.98 6.01 ±0.34 16.08 ±1.08## 3.88 ±0.34水 组 12 338.31 ±22.98# 5.89 ±0.18 12.31 ±0.70 4.18 ±0.39#

3.2 对子宫出血模型大鼠凝血功能的影响 与空白组比较，模型组大鼠PT (P ＜0.01)、APTT (P ＜0.01)、TT(P ＜0.05)明显延长，FIB 明显降低(P ＜0.01)。与模型组比较，宫血宁组、胶艾汤组可明显升高FIB (P ＜0.01)，缩短PT (P ＜0.01)、APTT (P ＜0.05)，胶艾汤组可明显缩短TT (P ＜0.01);乙酸乙酯组可明显缩短TT (P ＜0.01)、PT (P ＜0.01)、APTT (P ＜0.05)，升高FIB (P＜0.01);石油醚组可明显升高FIB (P ＜0.05);水组可明显缩短TT (P ＜0.05)，升高FIB (P ＜0.05)。实验结果见表2。

表2 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠凝血功能的影响(±s，n=10)

表2 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠凝血功能的影响(±s，n=10)

组别 剂量( ) ( )23.99 ±2.15 9.52 ±0.19 11.63 ±0.56 2.28 ±0.27模型组 - 28.41 ±4.44* 10.37 ±0.35＊＊ 13.06 ±0.98＊＊ 1.82 ±0.20＊＊宫血宁组 0.156 26.09 ±0.94 8.36 ±0.35## 11.51 ±1.08# 2.22 ±0.12##胶艾汤组 12 22.79 ±1.16## 9.45 ±0.60## 11.06 ±1.31# 2.23 ±0.17##石油醚组 12 26.86 ±1.14 9.88 ±0.51 12.37 ±0.44 2.11 ±0.25#乙酸乙酯组 12 21.78 ±1.04## 9.53 ±0.39## 11.11 ±1.26# 2.12 ±0.06##正丁醇组 12 24.80 ±0.58 9.56 ±1.55 12.24 ±1.48 2.13 ±0.42水 组 12 24.26 ±1.26# 10.00 ±0.78 12.35 ±1.71 2.19 ±0.33空白组-#

3.3 对子宫出血模型大鼠TXB2、6-keto-PGFla 的影响 与空白组比较，模型组TXB2明显降低(P ＜0.01)、6-keto-PGFla 明显升高(P ＜0.01)。与模型组比较，宫血宁组、胶艾汤组可明显升高TXB2(P ＜0.01)，降低6-keto-PGFla(P ＜0.01，P ＜0.05);乙酸乙酯组、水组可明显升高TXB2(P ＜0.01)、降低6-keto-PGFla (P ＜0.01，P ＜0.05);正丁醇组可明显降低6-keto-PGFla (P ＜0.01);各给药组(正丁醇组除外)均可调节TXB2/6-keto-PGFla 平衡。实验结果见表3。

表3 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠TXB2、6-keto-PGFla 的影响(±s，n=10)

表3 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠TXB2、6-keto-PGFla 的影响(±s，n=10)

组别 剂量/(g·kg -1) TXB2/(pg·mL -1) 6-keto-PGFla/(pg·mL -1) TXB2/6 -keto-PGFla空白组34.56 ±0.24 21.48 ±1.12 1.61 ±0.08模型组 - 21.69 ±2.54＊＊ 38.79 ±4.07＊＊ 0.58 ±0.08＊＊宫血宁组 0.156 27.69 ±1.76## 27.95 ±1.76## 0.99 ±0.08##胶艾汤组 12 33.86 ±0.43## 33.46 ±2.00# 1.01 ±0.06##石油醚组 12 22.98 ±0.96 36.05 ±2.02 0.64 ±0.05乙酸乙酯组 12 32.47 ±0.78## 25.44 ±1.27## 1.28 ±0.09##正丁醇组 12 25.18 ±3.82 25.07 ±1.83## 1.00 ±0.10##水 组 12 25.77 ±2.10## 35.08 ±2.15# 0.74 ±0.07-##

3.4 对子宫出血模型大鼠UBT、UBQ 的影响 与模型组比较，胶艾汤组、宫血宁组可明显减少UBQ (P ＜0.01)、缩短UBT (P ＜0.01，P ＜0.05);乙酸乙酯组、水组可明显减少UBQ (P ＜0.01，P ＜0.05)、缩短UBT (P ＜0.05)。实验结果见表4。

表4 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠UBT、UBQ 的影响(±s，n=10)

表4 胶艾汤及其各溶剂提取部位对子宫出血模型大鼠UBT、UBQ 的影响(±s，n=10)

组别 剂量/(g·kg -1)UBT/h UBQ/mL空白组- 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型组 - 148.00 ±38.45 0.43 ±0.04宫血宁组 0.156 96.00 ±15.18# 0.32 ±0.04##胶艾汤组 12 90.00 ±21.27## 0.33 ±0.02##石油醚组 12 129.00 ±31.26 0.40 ±0.02乙酸乙酯组 12 99.00 ±27.02# 0.33 ±0.03##正丁醇组 12 106.29 ±43.50 0.40 ±0.03水 组 12 109.71 ±23.42# 0.36 ±0.04#

3.5 对子宫出血模型大鼠子宫肉眼形态的影响 空白组大鼠子宫呈明显的结节状膨大，胚胎之间界限明显，色红润;模型组子宫可见胚胎之间界线不明显，有残留和瘀血，为不完全流产;其余各给药组子宫均未见明显结节，但有些子宫可见瘀血，子宫周围有充血现象。子宫肉眼形态学观察结果如图1 所示。

3.6 对子宫出血模型大鼠子宫组织形态学的影响 空白组大鼠子宫组织可见明显的滋养层细胞，处于正常妊娠期;模型组大鼠子宫组织无明显的滋养层细胞存在，但可见有明显瘀血现象，为不完全流产;其余各给药组子宫组织均无滋养层细胞，且可观察到有不同程度的蜕膜样变，其中乙酸乙酯组子宫组织无明显蜕膜样变，子宫内膜已恢复且处于增生期，说明乙酸乙酯部位最有利于促进产后子宫的复原。子宫组织形态学观察结果如图2 所示。

4 讨论

图1 不同给药组大鼠子宫肉眼形态图

图2 不同给药组大鼠子宫组织形态学图(HE，×100)

米非司酮联合米索前列醇用于终止早孕成功率可达90%以上［5］，现代研究表明，米非司酮可通过分子水平选择性地与孕酮受体结合，产生抗孕酮作用，使妊娠物失去孕激素的支持而发生绒毛组织及蜕膜变性，释放前列腺素，导致黄体生成素下降，黄体萎缩，从而使依赖黄体发育的胚囊坏死［6］，米索前列醇可提高子宫平滑肌的兴奋性，促使子宫收缩，宫颈软化，促进胚胎排除而终止妊娠［7］。与传统手术疗法相比较，药物流产具有安全性高、简便、高效、痛苦小等优点，米非司酮联合米索前列醇是目前临床常用的药物流产方法，且临床取得理想效果，故本实验选择米非司酮联合米索前列醇复制大鼠子宫出血模型。

宫血宁胶囊其原料为重楼［8］，文献研究表明，宫血宁胶囊的主要有效成分重楼皂苷可通过直接兴奋子宫平滑肌使子宫产生节律性收缩，增强子宫收缩力，从而促进蜕膜排出和子宫恢复，发挥抗早孕作用［9］，通过缩短出血、凝血时间，促进ADP 诱导的血小板聚集作用而达到明显的止血效果［10］。宫血宁胶囊还具有缩短子宫出血时间，减少子宫出血量等药理作用［11］，且临床研究表明［12］，药物流产者口服宫血宁后均未发现任何毒副作用，故本实验选择宫血宁胶囊作为阳性药。

文献研究表明［13］，米非司酮联合米索前列醇造成早孕大鼠不完全流产后破坏了下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA)的正常生理功能，使下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)减少，进而引起垂体分泌促黄体生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)分泌减少，卵巢分泌的孕酮(P)、雌二醇(E2)减少而降低子宫平滑肌对缩宫素的敏感性，从而导致药物流产后子宫出血时间(UBT)延长，子宫出血量(UBQ)增加，延缓子宫内膜的修复。药物流产后机体的内源性和外源性凝血系统被激活，APTT 主要反映内源性凝血途径中凝血因子的水平，PT 可反映外源性凝血途径的凝血因子水平［14］，药物流产后凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)明显延长，血浆纤维蛋白原(FIB)明显降低，同时机体内调控血小板功能最强大的一对物质［15］TXB2和6-keto-PGFla 平衡被破坏，促进血小板聚集和血管收缩的TXB2水平降低，促使血管扩张和抑制血小板聚集的6-keto-PGFla 水平升高。本实验研究中，与空白组比较，模型组大鼠E2、P、LH、FSH、FIB 明显降低，TT、PT、APTT 明显延长，TXB2明显降低，6-keto-PGFla 明显升高，UBT、UBQ 明显增大，表明子宫出血模型复制成功。与模型组比较，胶艾汤乙酸乙酯组可明显升高E2、P、LH、FSH，从而回调下丘脑-垂体-卵巢轴的生理功能，并回调因药物流产后所造成的机体内源性和外源性凝血系统的紊乱，明显缩短TT、PT、APTT、UBT，升高FIB、TXB2，减少UBQ，降低6-keto-PGFla，调节TXB2/6-keto-PGFla 平衡，从而表现出良好的保血作用;正丁醇组可明显升高LH，降低6-keto-PGFla，调节TXB2/6-keto-PGFla 平衡;水组可明显缩短TT、UBT，升高FIB、TXB2，减少UBQ，降低6-keto-PGFla，调节TXB2/6-keto-PGFla 平衡。综上所述，乙酸乙酯部位是胶艾汤止血作用的最有效部位，但胶艾汤发挥止血作用的活性成分群以及化学成分与药理作用之间的关联性还需进一步深入研究。

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