微波提取对桂枝-甘草药对化学成分影响的研究

黄一可， 万敬员 ， 夏之宁

(1. 重庆医科大学药学院，重庆400016;2. 重庆大学创新药物研究中心，重庆400030)

中药复方和配伍是中医临床用药的重要形式，而药对是中药配伍中最简单的组合，其功效并非仅是单味药物的简单相加，而是具有协同和拮抗作用，从而发挥综合疗效。目前，对中药的全面研究最终都落在复方上，而对复方的研究又是以中药药对的化学成分为切入点［1］。

中药的质量关键在于中药的有效成分，而提取工艺是否合理将直接影响到药材有效成分的提出，以及最终摄入人体中的药物的各种化学成分含有量和相对比例，尤其是对于复方中药制剂而言，正确的提取工艺是重要的一环。如今，常见的中药提取方法有很多，但大多存在提取率不高、原料浪费严重等缺点，不能满足高效、快速的要求［2］，而微波辅助提取被引入到中药化学成分的提取已有多年，并产生了理想的效果。微波辅助提取(microwave-assisted extraction，MAE)［3-5］，又称微波萃取或微波提取，是微波和传统的溶剂提取法相结合的一种提取技术，而且曾里等［6-10］已经报道了这一提取技术所具有的价值。

为了在已广泛研究的单味中药微波提取的基础上，进一步研究复方中药的微波提取，本实验将从药对这种最简单的复方入手，研究微波提取对药对中化学成分相对含有量的影响。

药对桂枝-甘草是《伤寒杂病论》中的群芳之冠，主要作用有解肌发表、调和营卫等［11］。本实验选择这一药对为研究对象，以单味中药微波提取液的HPLC 分析结果为含有量的评价基础［12-14］，以药对的总提取率、组药的相对提取率，以及单味药不同极性成分的相对提取比例为依据，对单味药桂枝、甘草和其药对中的有效化学成分含有量进行比较分析，得到微波与溶剂的交互作用规律，为中药药对的现代化研究和制备工艺的优化提供一定依据。

1 材料、试剂与仪器

甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，产地新疆)、桂枝(Cinnamomi Ramulus，产地广西)饮片(重庆市沙坪坝区和平药房)，经重庆大学药学系杨丰庆副教授和夏之宁教授鉴定，均为甘草和桂枝正品。

甘草酸(纯度＞98%，批号1405-85-3)、桂皮醛(纯度99%，批号14371-10-9)对照品(阿拉丁试剂上海有限公司);乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

LWMC-205 微波化学反应器，可调节功率(南京陵江科技开发有限公司);Agilent 1260 HPLC 色谱仪(美国Agilent Technologies 公司);LG-16A 高速冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司);AY-120 分析天平(日本岛津公司)。

2 方法

2.1 相对提取率及其计算方法 药对的两种中药按中医药原则组成后进行提取，然后HPLC 法对提取液进行分析，将来自于A 药的色谱峰面积命名为Aa，来自于B 药的成分的色谱峰面积命名为Ab。相对提取率是指药对中单味药的提出总量与两种中药提取成分的总量之比，近似于该组分峰面积总和(假设各组分都有同一检测波长下的吸收能力，且吸光系数相同)与所有色谱峰面积之和的比值，能反映药对中两种单味药提取量的相对值，所以计算公式为

2.2 传统回流法提取单味药及其药对 分别称取桂枝饮片8 g、甘草饮片4 g 以及桂枝-甘草药对饮片12 g (含桂枝8 g、甘草4 g)，加入不同极性的提取溶剂24 mL，60 ℃下加热15 min，离心，所得到的上清液即分别为桂枝、甘草以及桂枝-甘草的提取液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得传统回流法提取样品。

2.3 微波提取单味药及药对 分别称取桂枝饮片8 g、甘草饮片4 g 以及桂枝-甘草药对饮片12 g (含桂枝8 g、甘草4 g)，加入不同极性的的提取溶剂24.0 mL，80 ℃下微波提取4 min，离心，得到上清液，然后0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得微波提取样品。

2.4 对照溶液与加入对照品样品的制备 分别称取甘草酸和桂皮醛对照品粉末适量，加入60%乙醇，摇匀，即得质量浓度分别为0.5 和0.1 mg/mL 的对照品溶液。

取提取液若干份，每份0.5 mL，依次加入甘草酸对照溶液0、1、2、3、4、5 mL 和桂皮醛对照溶液0、5、10、15、20、25 mL，定容至100 mL，摇匀，即得对照品样品(质量浓度分别为0、5、10、15、20、25 μg/mL)。

2.5 色谱条件 参考甘草［14］、桂枝［15］和桂枝汤HPLC 分析方法［12-13］，并结合实验实际情况，确定条件为Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0 ～40 min，20% ～40%B;40 ～60 min，40% ～80%B;60 ～70 min，80%B);体积流量1.0 mL/min;检测波长254 nm;进样量10 μL。

3 结果与讨论

3.1 微波协同溶剂对药对及组药提取的影响 提取药对后，HPLC 法分析了不同微波功率(0、40、80、120、160、200、400 W)下的药对提取液，见图1 和图2。其中，图1A 和1B 有明显差异性，说明采用不同溶剂提取时，提取物存在化学上的不同。另外，各图中相同化学成分的峰面积大小也存在一定区别，但总体都随微波功率而增加，说明各成分在微波作用下提取率上升，而且药对的总提取率和其中各单味药(甘草和桂枝)的提取率均明显提高。但是，图2A 和2B 显示，微波对甘草和桂枝总峰面积有不同的影响，而且这种影响与功率和提取溶剂有关。当提取溶剂为纯乙醇时，能得到更多甘草中的化学成分，且大多为极性较小的化学物质(在反相液相色谱中出峰相对较晚);当提取溶剂为去离子水时，能得到更多桂枝中的化学成分。

图1 药对提取液的HPLC 图

另外，图2 还表明，随着微波功率的增加，药对中桂枝的相对提取率也随之上升，而甘草相对提取率的总体趋势则在下降。对于药对中的甘草部分，醇提比水提有更高的相对提取率(醇提50% ～60%，水提20% ～40%)，而桂枝部分则相反(醇提38% ～50%，水提60% ～80%)。而且，纯乙醇作为提取溶剂时，药对中甘草和桂枝部分的相对提取率都有明显变化，变化率约为15%，并且微波功率的不同，桂枝与甘草组分的增减变化情况恰好相反。也就是说，如果采用400 W 微波提取，使用水作溶剂时，甘草的相对含有量将减少一倍左右，而桂枝则将增加一倍。

图2 药对提取成分的相对含有量随微波功率的变化

3.2 不同极性组分的提取率与微波功率的关系 以桂枝为例，考察不同极性组分的提取率与微波功率的关系。结果发现，微波提取中药时，因提取成分中的分子极性不同，提取率会有较大差异。由图3 可知，在50 ～200 W 功率下，较大极性成分(桂皮醛，logP=1.90)的相对提取率增加，而较小极性成分(桂皮酸，logP =1.50)的相对提取率减小，表明微波功率对不同极性成分的提取率有影响。在120 W 下，微波对极性较小的物质具有较好的提取效率，可能与微波、分子极性、组分介电损耗值、提取溶剂极性等因素相关，具体尚有待于进一步研究。

药对中的甘草酸和桂皮醛均能溶于乙醇中，因此乙醇-水系统可同时满足甘草酸(logP=3.7)和桂皮醛(logP =1.9)的提取需要。图4 和表1 显示，当乙醇体积分数为40%时，桂皮醛的提取率最高;随着去离子水体积分数增加，甘草酸的提取率逐渐上升;当完全用去离子水作为提取溶剂时，甘草酸的提取率最大，由0.49 mg/g 增加到6.69 mg/g，是纯乙醇提取时的13.7 倍左右，而且甘草酸与桂皮醛的提取比最低为0.55，最高为3.83，相差较大。以上结果显示，在药对提取过程中，提取溶剂的组成会影响提取物的化学成分比例，不同组成的提取溶剂在微波作用下，提取液中化学成分的比例可能也将会有所差异。

图3 桂枝的不同极性组分提取率与微波功率的关系

图4 药对中两种有效成分提取率随提取溶剂组成的变化情况

表1 甘草酸与桂皮醛提取率之比

3.3 微波提取药对有效成分 在药对中，桂枝的主要化学成分为桂皮醛，而甘草的主要化学成分为甘草酸，因此在制备工艺上得到这两个化合物的提取率将具有一定价值。当本实验提取溶剂为40%乙醇，微波功率为200 W 时，甘草酸的提取率为5.65 mg/g，而桂皮醛的提取率为2.52 mg/g。得到相应HPLC 色谱图后，加入并标示0.50 mg/mL甘草酸对照溶液和0.10 mg/mL 桂皮醛对照溶液，见图5。由图可知，甘草酸的保留时间在57 min 左右，而桂皮醛的保留时间在34 min 左右。

然后，继续以加入对照品测定两者的提取率，结果见表2。由表可知，微波提取4 min 时的提取率高于加热回流15 min，而且在此提取方法下，两种有效成分的提取更加充分和趋于完全。

图5 40%乙醇作提取液时，微波提取桂枝-甘草药对的HPLC 图

表2 微波辅助提取与传统回流提取药对两种化学成分的比较

4 结论

本实验研究了微波提取对桂枝-甘草药对化学成分的影响。结果发现，当提取溶剂为40%乙醇，微波功率为200 W，提取时间为4 min，桂枝-甘草饮片药对取12 g 时，主要化学成分甘草酸的提取率为5.65 mg/g，而桂皮醛的提取率为2.52 mg/g。因此可知，微波提取能大大缩短提取时间，提高提取效率，但对两种单味药(桂枝和甘草)的相对提取率具有一定选择性。而且，微波功率对提取液中不同极性成分的提取率有较大影响，另外分别以纯乙醇和去离子水作为提取溶剂进行微波提取时，提取液中化学成分的相对含有量也有较大的不同。综上所述，在微波提取中药药对或复方中药时，应关注微波功率与提取溶剂对中药中化学成分的相对比例，乃至药效和组药原则的影响。

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