表没食子儿茶素没食子酸酯对HPV11 早期基因E6、E7mRNA 表达的影响

孙 洋 李新宇 宋莎莎 王永芳 顾 恒

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属小DNA 病毒，其早期基因(E1 ～E7)编码的早期蛋白与病毒致病性密切相关，尤其是E6、E7 基因与p53、pRb 结合，致感染细胞生物学活性发生改变，导致相关疾病发生［1］。高危型HPV(如HPV16、HPV18)可致感染细胞发生永生化改变，与肿瘤的发生相关。低危型HPV(如HPV6、HPV11)感染通常引起肛门、生殖器部位的良性增生。但也有研究发现，少数头颈部鳞癌患者病灶中仅能检测到HPV6 及HPV11，提示低危型HPV 感染所引起的病变亦不全为良性［2］。近年来，由低危型HPV 感染引起的尖锐湿疣发生率迅速升高，患者携带的病毒通过性接触传播，成为严峻的公共卫生问题。

2006 年美国食品和药物管理局(FDA)批准茶多酚作为新的处方药，用于局部外用治疗外生殖器和肛周疣(尖锐湿疣)。这是FDA 根据1962 年药品修正案条例首个批准上市的植物药。茶多酚中的主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)-epigallocatechin-3 -gallate，EGCG］具有多种药理学效应，如抗氧化、抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用。关于这两种化合物对于感染低危型HPV 细胞的增殖以及病毒早期基因表达的影响报道不多。

本研究利用我们前期构建的携带HPV11 全基因组的HaCaT 角质形成细胞(下文简称为HPV11.HaCaT)，探讨EGCG 对HPV11.HaCaT 细胞生长增殖的影响，以及对HPV11.HaCaT 细胞中HPV11 早期基因E6、E7mRNA 表达的影响［3～5］。

材料与方法

1.材料:(1)细胞:HaCaT 细胞;HPV11. HaCaT 细胞，本实验室在前期研究中通过环化HPV11 全长DNA 后，将环化质粒经脂质体转染至HaCaT 角质形成细胞构建而成［4，6］。(2)受试物和试剂:EGCG(美国Sigma 公司)，溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，美国Sigma 公司)中，配制成浓度为100mmol/L 的贮存液，-20℃避光保存。实验中，将上述贮存液用含10%新生牛血清的DMEM(美国Gibco 公司)培养基稀释至所需浓度，各组培养基中最终DMSO 的含量为0.10% ～0.01%(v/v)。四甲基偶氮唑盐(methyl thiazoly tetrazolium，MTT，美国Sigma 公司)。Trizol(美国invitrgen 公司)。Reverse Transcription System(美国Prmega 公司)。SYBR®Select Master Mix，(美国Applied Biosystems 公司)。(3)仪器:酶联免疫检测仪(Thermo 公司);7300 型实时荧光定量PCR 仪(美国Applied Biosystems 公司)。

2.实验方法:(1)细胞培养:HaCaT 细胞及HPV11.HaCaT细胞培养于含10% 新生牛血清的DMEM 培养基中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。(2)实验分组:将对数生长期的HaCaT 和HPV11. HaCaT 细胞分为实验组(加不同浓度EGCG)、溶媒对照组(加与各浓度实验组对应的DMSO量)、无药对照组。(3)细胞增殖测定:将HaCaT 细胞、HPV11.HaCaT 细胞接种于96 孔板中(2 ×104个细胞/孔)培养过夜，然后分别加入设置浓度的各组药液(200 微升/孔):实验组终浓度分别为EGCG 10、25、50、100μmol/L;溶媒对照组分别为DMSO 含量0.01%、0.025%、0.05%、0.1%;无药对照组加等量培养基，每组设3 个复孔。分别培养24 和48h后，加5mg/ml MTT 液20 微升/孔，继续培养4h 后，弃培养基，加入150 微升/孔DMSO 避光震荡混匀10min，使蓝紫色沉淀充分溶解，在酶标仪下以550nm 波长测定吸光度。(4)实时荧光定量PCR:根据细胞增殖试验的结果，选择EGCG 100μmol/L、50μmol/L 作为实验浓度，同时设0.1% DMSO 溶媒对照及无药对照，药液分别处理HPV11.HaCaT 细胞12h 和24h 后，用Trizol 提取细胞总RNA。将总RNA 反转录为第1链cDNA。利用Primer-Blast 软件设计针对HPV11 E6、E7 的荧光定量PCR 引物(表1)并合成(生工生物工程股份有限公司)。目的基因mRNA 水平通过7300 型实时荧光定量PCR仪测定。扩增体系为10μl SYBR®Select Master Mix，1. 5μl cDNA，上下游引物各0.8μl，无核酶水6.9μl，总体系为20μl。扩增条件为:50℃2min，95℃2min，95℃15s，58℃15s，72℃1min，重复40 个循环，并添加熔解曲线以确保扩增产物的特异性。每个样品设3 个复孔，同时设内参(β-actin)对照。结果通过△△Ct 法分析。

表1 引物设计

5.统计学方法:用SPSS 18.0 软件进行分析，试验重复3次，结果用方差齐性检验。多组间比较用单因素方差分析及LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1. EGCG 对HPV11. HaCaT 细胞增殖的影响:MTT 比色法结果显示，EGCG 在10 ～100μmol/L 受试浓度范围内对HaCaT 细胞及HPV11. HaCaT 细胞抑制作用相对较弱(细胞生存率为分别为52% ～95%、64% ～90%)，但显示有时间和剂量依赖趋势(图1、图2)。

图1 EGCG 对HaCaT 细胞生长的抑制作用

图2 EGCG 对HPV11.HaCaT 细胞生长的抑制作用

2.EGCG 对HPV11.HaCaT 细胞中HPV11 E6、E-7mRNA 表达的影响:实时荧光定量PCR 结果显示，EGCG 在50μmol/L 和100μmol/L 浓度，均可不同程度地抑制HPV11.HaCaT 细胞中HPV11E6、E7 mRNA的表达，与溶媒对照及无药对照比较，差异均具有统计学意义(P ＜0.05，图3、图4)。EGCG 作用24h 时对E6、E7 mRNA 的抑制作用均强于作用12h(P ＜0.05)，但12h 的结果中，低浓度组(50μmol/L)的E6 mRNA 表达量仅为15%，而高浓度组(100μmol/L)反而为30%，两者差异具有统计学意义(P ＜0.05);而24h 的结果中，EGCG 两浓度组间差异无统计学意义(P ＞0.05)。两浓度组的EGCG 对E7 mRNA 表达的抑制作用相当(P ＞0.05)。

图3 EGCG 对HPV11 E6 mRNA 影响

图4 EGCG 对HPV11 E7 mRNA 影响

讨 论

HPV 病毒的宿主细胞为人的皮肤和黏膜上皮细胞。根据其完整基因组的不同，目前已测得的HPV可分为100 多种亚型。不同基因型的病毒组织亲嗜性和致病谱不同，低危型HPV11 易感染生殖器和咽喉部位。近年来，由低危型HPV 感染引起的尖锐湿疣发生率迅速升高，目前尖锐湿疣是我国常见的性传播疾病之一。90%的尖锐湿疣患者皮损中均能检测到HPV11 和HPV6 感染。一些巨大型的尖锐湿疣还有恶变的可能。

虽然2006 年FDA 已批准茶多酚用于外用治疗尖锐湿疣，但在我国临床上的应用有限。目前临床上常用的尖锐湿疣的治疗手段包括激光、冷冻等局部物理疗法，和鬼臼毒素、咪喹莫特等局部外用药物治疗，以及氨基酮戊酸光动力学疗法等。这些治疗方法主要通过清除临床可见的疣体以及调节局部免疫功能来发挥治疗作用。但对于引起尖锐湿疣的病毒本身，并无直接杀伤作用。因此这些治疗手段在不良反应发生率、治愈率和复发率等方面都存在一定问题。

茶多酚作为新的尖锐湿疣处方药，其中的主要活性成分EGCG 具有抗氧化、抗病毒及抗肿瘤作用。但关于这两种化合物对HPV 病毒基因影响的研究报道较少。本研究利用笔者前期构建的含HPV11 基因组HaCaT 细胞(HPV11. HaCaT)，首先观察了EGCG 对普通HaCaT 细胞以及HPV11.HaCaT 细胞生长、增殖的影响。结果表明，EGCG 对HaCaT 和HPV11.HaCaT 细胞的生长、增殖均有一定的抑制作用。在一定浓度范围内这种抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性。该结果提示，EGCG 可在一定程度上通过抑制HPV11 感染细胞的增殖而改变感染细胞的生长状态。

HPV 病毒基因主要由上游调节区(URR)、早期基因区(E)、晚期基因区(L)组成，其中早期基因(E1 ～E7)编码的早期蛋白与病毒致病性密切相关，尤其E6、E7 基因直接对宿主细胞作用。高危型HPV感染机体后，病毒基因组常整合于宿主细胞染色体内，病毒不再维持自身的生命周期，而是跟随宿主细胞的DNA 复制传至子代细胞。高危型HPV 基因组在整合过程中发生多个早期基因开放阅读框架缺失(如E1、E2、E4、E5)，导致E6 和E7 基因表达失调，宿主细胞向恶性表型发展。而低危型HPV 感染宿主后，病毒基因组与宿主细胞染色体间不发生整合，而是以外源性DNA 方式游离于宿主细胞染色体外。高危型HPV 感染细胞中，病毒E6 蛋白与宿主细胞p53结合、E7 蛋白与pRb 结合，导致细胞发生永生化改变;同时E6、E7 蛋白亦可抑制感染细胞中STAT1 的表达，以维持病毒基因的复制［6］。低危型HPV 感染细胞中，E6 和E7 蛋白依然可以分别与p53、pRb 结合，虽然这种结合的亲和力较高危型低，甚至仅为高危型结和力的1/10［7］。但E6、E7 作为HPV 病毒的早期功能基因仍然在低危型HPV 病毒的致病和免疫逃逸等方面发挥重要作用。

由于低危型HPV E6、E7 蛋白的抗体未商品化，只能初步根据E6、E7mRNA 的表达判断其被EGCG抑制的程度。根据细胞增殖试验的结果，笔者选择了对HPV11. HaCaT 细胞抑制作用相对强且无毒性作用(细胞存活率＞80%)的高浓度组，观察其对HPV11.HaCaT 细胞中HPV11 E6 和E7 基因mRNA表达的影响。结果表明，EGCG 可降低HPV11.HaCaT 细胞中HPV11 E6 和E7 基因mRNA 表达水平，其相对表达量＜50%，这提示EGCG 除了能直接抑制感染细胞的生长增殖外，还能通过抑制感染细胞中HPV11 早期基因E6、E7 的表达而抑制病毒。试验中还发现，EGCG 作用24h 时对E6、E7 mRNA 的抑制作用强于12h(P ＜0.05)，但作用12h 后，50μmol/L EGCG 对E6 mRNA 的抑制作用反而强于100μmol/L，两者差异具有统计学意义(P ＜0.05);而24h 的结果中，EGCG 两浓度组间差异无统计学意义(P ＞0.05)。两浓度组的EGCG 对E7 mRNA 表达的抑制作用相当(P ＞0.05)。推测EGCG 抑制HPV11 E6表达后可能激发了感染细胞内某些旁路途径的反馈调节，后者又部分促进了病毒基因E6 的表达，亦有可能高浓度化合物作用使某些信号通路发生激活或其他改变，但具体的信号通路及作用机制尚需进一步研究及证实。

以上研究结果提示，EGCG 在一定作用浓度下，可通过抑制HPV11 感染细胞的生长增殖和病毒早期基因E6、E7 表达而影响抑制病毒的作用。有关EGCG 是否因为对E6 和E7 基因表达的影响而改变了宿主细胞相关信号通路的活化，进而影响感染细胞的多种生物学活性目前正在研究中。

1 Boulet G，Horvath C，Vanden Broeck D，et al. Human papillomavirus:E6 and E7 oncogens［J］. Int J Biochem Cell Biol，2007，39(11):2006 -2011

2 Syrjänen S. The role of human papillomavirus infection in head and neck cancers［J］. Ann Oncol，2010，21(Suppl 7):vii243 -245

3 吴剑波，李新宇，郑家润. 人乳头瘤病毒11 型基因组DNA 在HaCaT 株中的转染［J］.中华皮肤科杂志，2009，42(2):85 -87

4 王永芳，李新宇，宋莎莎，等. 携带HPV11 型基因组细胞三维培养模型的建立及其衣壳蛋白L1 的表达［J］.中国艾滋病性病，2010，16(2):105 -108

5 Yongfang W，Xinyu L，Shasha S，et al. Development of basal - Like HaCaT keratinocytes containing the genome of human papillomavirus(HPV)type 11 for screening of anti - HPV effects［J］. J Biomol Screen，2014

6 Hong S，Mehta KP，Laimins LA. Suppression of STAT-1 expression by human papillomaviruses is necessary for differentiation - dependent genome amplification and plasmid maintenance［J］. J Virol，2011，85(18):9486 -9494

7 Oh ST，Longworth MS，Laimins LA. Roles of the E6 and E7 proteins in the life cycle of low-risk human papillomavirus type 11［J］. J Virol，2004，78(5):2620 -2626