Th1/Th2 细胞相关因子及免疫状态与肝癌发生及家族聚集性中的关系

王劲松 何秀梅 陈中琦 龚紫泉 詹银楚

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在我国是高发性恶性肿瘤之一，而乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC 高发的主要原因，此外遗传因素、环境条件及免疫状态也与原发性肝癌有关［1～4］。在我国，HBV 引起的肝衰竭占所有肝衰竭的比例高达75%，且病死率高［5，6］。辅助性T 淋巴细胞与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，其根据其分泌细胞因子的不同可以分为Th1 和Th2 两个亚群。Th1 在肿瘤免疫中有重要作用，Th2 则可以抑制Th1 细胞分泌细胞因子，促进体液免疫应答。目前，Th1/Th2 细胞相关因子及免疫状态在肝癌发生及家族聚集性中的作用尚未见报道。本实验通过检测来自肝癌高发家族患者癌症患者、未患肝癌的患者和无癌家族患者的血清Th1/Th2 细胞因子水平，对Th1/Th2 细胞相关因子的作用进行初步探究，以期为HCC 的临床诊断和治疗做出可行性指导。

资料与方法

1.一般资料:选择2011 年2 月～2014 年2 月于笔者医院进行就诊的肝癌高发区域的肝癌患者和健康体检者。调查后，根据纳入标准和排除标准选取肝癌高发家族癌症患者30例(A 组)、肝癌高发家族未患肝癌患者45 例(B 组)和无癌家族患者75 例(C 组)。其中肝癌高发家族成员的标准是血缘关系亲属中有两例或以上患者，无癌家族成员是指与高发家族成员居住与同以区域，但与高发家族无血缘关系的家庭成员中不存在癌症患者的成员［7］。本实验诊断标准参照流行病学方法。纳入标准:各个患者年龄上下差距＜5 岁，具有相同的生活习惯和生活环境，相同民族，相同HBV 感染或携带。排除标准:排除甲、丙、丁和戊肝炎病毒感染者，排除酒精性、自身免疫性和药物性肝癌HBV/HCV 重叠感染者。

2.研究方法:(1)血清收集:取各组空腹静脉血10ml，其中5ml 经2h 静置后离心10min，分离出血清。另外5ml 加入肝素抗凝后保存于-80°C 冰箱待测。(2)血清IFN - γ 和IL-10 检测方法:采用ELISA 试剂盒(美国Rapidbio 公司)检测血清IFN -γ 和IL -10 水平。严格按照ELISA 试剂盒操作，待测样本加入10μl 标准品、40μl 样本稀释液和50μl 酶标工作液，在37℃恒温箱孵育30min，洗板4 次后每孔加入显色A 液50μl，显色B 液50μl，37℃避光显色15min 后每孔加50μl终止液。反应终止15min 后，以空白孔调零，在450nm 波长下测定各组的吸光度值。根据标准品的浓度及对应的OD 值，参考标准曲线方程，计算出对应的样品浓度，最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

3.统计学方法:所有数据结果均采用SPSS 13.0 统计学软件进行分析，并对血清IFN -γ 和IL -10 检测结果进行正态性检验，呈正态分布资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本的t 检验，多组间比较采用单因素方差分析;非正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示，采用非参数检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.患者一般情况比较:肝癌高发家族癌症患者30 例(A 组)、癌高发家族未患肝癌患者45 例(B 组)和无癌家族患者75 例(C 组)。按A 组和C 组、B 组和C 组配对进行对比研究。各组人群的丙氨酸氨基转移酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(glutamic - oxaloacetic transaminase，AST)等生物化学指标水平见表1。与无癌家族患者相比较，肝癌高发家族癌症患者和未患癌患者的血清ALT、AST 等生物化学指标水平上差异均无统计学意义(P ＞0.05)。

表1 各组人群的生物化学指标水平

2.血清IFN-γ 和IL -10 表达水平:血清IFN -γ 和IL-10 表达水平检测结果如表2 所示。

表2 各组人群的血清IFN-γ 和IL-10 表达水平检测结果

肝癌高发家族癌症患者的IFN -γ 水平显著低于癌高发家族无癌患者和无癌家族成员，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。而IL-10 水平显著高于癌高发家族无癌患者和无癌家族成员，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。而肝癌高发家族无癌患者IFN - γ水平和IL-10 水平癌症患者具有相同的变化趋势，但是较无癌家族成员比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

由图1 可看出，IFN -γ 水平随着肝癌的发展逐渐增加，即肝癌高发家族癌症患者的IFN -γ 水平显著低于肝癌高发家族无癌患者和无癌家族成员(P ＜0.05)，而癌高发家族无癌患者和无癌家族成员的IFN-γ 水平差异无统计学意义(P ＞0.05)。相反，IL-10水平随着肝癌的发展逐渐降低，即肝癌高发家族癌症患者的IFN -γ 水平显著高于癌高发家族无癌患者和无癌家族成员(P ＜0.05)，肝癌高发家族无癌患者和无癌家族成员的IL-10 水平差异无统计学意义(P ＞0.05)。

图1 各组人群的血清IFN-γ 和IL-10 表达水平

3.血清细胞因子表达水平与临床特征的关系:肝癌高发家族男性成员IFN -γ 水平低于无癌家族男性成员，IL-10 的水平显著高于无癌家族男性成员，差异均具有统计学意义(P ＜0.05);肝癌高发家族女性IFN-γ 和IL -10 水平与无癌家族女性比较差异无统计学意义。在肝癌高发家族HBsAg 阳性者中，患有肝癌的家族成员IFN -γ 水平低于无癌家族，而IL-10 的水平则高于对照组，差异具有统计学意义(P ＜0. 05)。在未患肝癌的HBsAg 阳性成员中，IFN-γ 和IL-10 水平与肝癌家族成员变化趋势相同，但是差异无统计学意义(P ＞0.05，表3)。

讨 论

在我国，HCC 是发生率较高的恶性肿瘤，且病死率高［8］。目前针对肝癌发生前机体Th1/Th2 细胞相关因子及免疫状态在肝癌发生及家族聚集性中的作用及特征少见报道。Th1/Th2 型细胞相关因子在机体抵御肿瘤发生过程中发挥关键的作用，可促进机体的免疫应答，增强机体抵抗力［9，10］。Th1诱导细胞免疫，Th2 诱导体液免疫。IFN-γ 和IL -10 分别源于Th1/Th2 型细胞，其作用是维持免疫系统功能和保证生理平衡［11，12］。很多肿瘤相关疾病的发生与IFN-γ 和IL -10 功能异常相关［13，14］。在正常状态下，Th1/Th2 在机体中处于平衡状态，无论向Th1或者Th2 任一方向漂移都会引起机体功能的异常［15，16］。

表3 不同临床特征家族成员IFN-γ 与IL-10 水平

本研究发现，与无癌家族患者相比较，肝癌高发家族癌症患者和未患癌患者的血清ALT、AST 等生物化学指标水平上差异均无统计学意义。肝癌高发家族癌症患者的血清IFN -γ 水平显著低于肝癌高发家族无癌患者和无癌家族成员(P ＜0.05)，而IL-10水平显著高于癌高发家族无癌患者和无癌家族成员。即肝癌高发家族癌症患者的Th1 /Th2 平衡状态向Th2 漂移。因此可以推断肝癌高发家族癌症患者的肿瘤产生原因可能是Th1 诱导的细胞免疫受到抑制，干扰了机体对肿瘤细胞的清除，从而促进了肝脏肿瘤的发生，增加了患肝癌的概率。此外，夏妍等［17］报道，Th1/Th2 平衡状态向Th2 漂移是HBV 慢性感染的原因之一。Th2 与脂肪肝、慢性HBV 感染和HCC等都一定关系［18］。

肝癌高发家族中无癌患者的血清IFN -γ 水平略低于无癌家族成员，而IL -10 水平略高于无癌家族成员。这提示，肝癌高发家族中无癌患者的Th1/Th2 平衡状态也有向Th2 漂移的倾向，免疫功能下降。这说明在癌症发生之前，肝癌高发家族中无癌患者的Th1/Th2 已经发生变化，其原因可能与遗传和环境等因素有关。Tilg 等［19］报道，慢性HBV 患者的肝损伤过程有相关细胞因子的参与，但机体免疫功能异常与HBV 慢性感染之间的关系尚不明确，是机体的免疫功能异常导致了HBV 慢性感染，还是HBV 慢性感染导致了机体的免疫功能异常有待于进一步研究。莫金英等［20］认为，某些等位基因的表达或缺失而导致的血清中Th1/Th2 失衡与肝癌症家族聚集性密切相关。本研究结果显示肝癌高发家族的男性有Th1/Th2 平衡向Th2 偏移的倾向，这可能是因为肝癌高发家族中男性的细胞免疫功能受到显著抑制，使机体对HBV 的侵袭更加敏感。同时肝癌高发家族成员HBsAg 阳性的患者也存在Th1/Th2 平衡失调的趋势，Th2 表达增多，细胞免疫受到抑制，进而增加HBV感染的概率。肝癌高发家族中未患病的成员Th1/Th2 水平无明显变化，这说明Th1/Th2 的变化是肝癌发展过程中逐渐变化的。

综上所述，本实验通过探讨机体Th1/Th2 细胞相关因子及免疫状态在肝癌发生及家族聚集性中的作用，发现了肝癌高发家族有Th2 表达倾向性的特点，血清中Th1/Th2 失衡与肝癌症家族聚集性密切相关，为Th1/Th2 细胞相关因子及免疫状态在肝癌发生及家族聚集性中的作用研究提供了新思路。

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