槐米提取物的制备工艺及其紫外吸收特性考察

史方超 乔立业 陆 崟 苏 华 任海祥南京军区南京总医院制剂科，江苏南京 210002

槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的花蕾，已有2000 多年药用历史，《神农本草经》还将其列为上品。 槐米中含有芦丁、槲皮素、三萜皂苷、多糖黏液质等成分，芦丁为主要成分[1]。 芦丁是天然的黄酮类化合物，维生素P 的主要组分之一[2]。近年来有不少国内外医药工作者对芦丁的药理作用进行过研究， 槐米中芦丁的含量高达12%～20%[3]。 研究表明，芦丁有抗癌防癌、镇痛、降血压、预防中风、抗菌抗病毒、抗衰老、抗炎抗过敏、抗自由基及抗氧化等多种作用[4-5]。 芦丁能增强毛细管的韧性，增强血管壁的弹性，对高血压患者具有防止脑血管破裂功效，具有较强的药理作用[6]。 本研究采用超声波提取法提取槐米，以多指标考察提取成分，并以槐米中芦丁含量为考察指标进一步研究，最后确定了槐米主要防晒成分芦丁的提取工艺，为槐米芦丁在工业化生产及化妆品防晒霜中的开发提供了实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260 型高效液相色谱仪，KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），UV-2100型紫外-分光光度计（岛津仪器上海有限公司），AE240电子分析天平（METTLER TOLEDO 精密仪器有限公司），FA1204S 分析天平（上海市精密仪器有限公司），密封式摇摆型粉碎机CF-6A（江苏金坛市医疗药材器械厂）。

1.2 试药

槐米（批号：121010，南京海源药事服务有限公司中药饮片厂）， 经南京军区南京总医院王曙东主任药师鉴定为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾。芦丁对照品（批号：100080-200707，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 槐米的提取

将槐米粉碎后， 取0.5 g 槐米细粉置50 mL 容量瓶中，加入15 mL 70%乙醇，在65℃下超声提取30 min。超声后过滤并定容至50 mL 容量瓶中，重复提取两次，合并提取液，精密吸取提取液1 mL，定容到25 mL 容量瓶中制成供试品液。

2.2 槐米提取液的紫外吸收

取槐米供试品液1 mL，加70%乙醇定容至25 mL容量瓶中，以70%乙醇为空白，在200～400 nm 范围内进行紫外扫描，确定各波长下的吸光度值。 分别计算UVC（200～280 nm）、UVB（280～320 nm）、UVA（320～400 nm）各区间平均吸光度值。

2.3 芦丁的含量测定[7]

2.3.1 最大吸收波长的选择 精取一定量的对照品于50 mL 量瓶中，用甲醇定容，进行紫外扫描，测得最大吸收波长为257 nm。 见图1。

图1 对照品芦丁的紫外吸收图

2.3.2 色谱条件的选择[8-9]色谱柱：Lichrospher 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%冰醋酸（45∶55），流速1 mL/min，检测波长257 nm，柱温30℃。样品溶液过0.45 μm 微孔滤膜，进样10 μL。 见图2。

图2 芦丁HPLC 图

2.3.3 对照品储备液的制备 精密称取于110℃干燥至恒重的芦丁对照品20.48 mg，加甲醇定容至50 mL 容量瓶中，摇匀，作为对照品储备液（含芦丁0.4096 mg/mL）。

2.3.4 供试品溶液的制备 样品溶液的制备：精密称取本品（药材）0.03 g，置50 mL 容量瓶中，加70%乙醇适量，65℃下超声提取30 min 使溶解，取出放冷至室温，70%乙醇定容至刻度，摇匀，再用0.45 μm 微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.3.3”项下芦丁对照品储备液各0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL， 置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。 经0.45 μm 的微孔滤膜滤过后，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪中，按“2.3.2”项下方法进行测定，以对照品的进样量为横坐标（X），对照品的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y=18 630X+9.9292（r＝1，n＝5）。 结果表明芦丁进样量在0.02048～0.32768 mg/mL 范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.6 精密度试验 取“2.3.3”项下芦丁对照品溶液，按“2.3.2”项下液相色谱条件，连续进样5 次，芦丁峰面积的RSD 为0.15%（n＝5）。

2.3.7 重复性试验 分别精密称定本品5 份， 按照“2.3.4”项下供试品溶液制备得到5 份供试品溶液，分别精密吸取10 μL 注入液相色谱仪中，记录芦丁峰面积，以外标法计算各供试品中芦丁的含量，结果平均含量为207.98 mg/g，RSD 为0.8%（n＝5）。

2.3.8 稳定性试验 照“2.3.4”项下方法制备供试品溶液，采用“2.3.2”项下液相色谱条件，分别在0、2、4、6、8 h 进样10 μL，记录芦丁峰面积，测定供试品标示含量，RSD 为0.23%， 表明供试品溶液在8 h 内稳定性良好，符合实验需要。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取槐米细粉 （60 目）0.015 g，共9 份，分别置9 个50 mL 量瓶中，分别精密加入“2.3.3”项下的芦丁对照品溶液作为储备液。储备液4、5、6 mL 各3 份， 制成低、 中、 高浓度三组，按“2.3.4”项下的方法制备即得。分别精密吸取10 μL 注入液相色谱仪，计算各供试品含量，结果平均加样回收率为98.15%，RSD 为2.25%（n=9）。

2.4 单因素考察

2.4.1 紫外吸收的单因素考察 以乙醇为提取溶剂，分别从乙醇浓度、超声时间、超声温度、料液比、提取次数方面对槐米提取液的吸光度值的变化进行考察。见图3。

图3 紫外吸收的单因素实验结果

由图3A 可见，在不同乙醇浓度下，槐米提取液在各紫外区间的平均吸光度值先升高后降低，在乙醇60%浓度下为最高， 紫外辐射UVR （UVR=UVA+UVB+UVC）=1.741（n=3）；图3B 显示，在不同的料液比条件下，槐米提取液的紫外平均吸光度值先升高后降低，在料液比1∶30 条件下，紫外平均吸光度值相对最高，UVR=1.576（n=3）；图3C 表明，在不同的超声温度条件下，槐米提取液的紫外平均吸光度值先升高后略有降低， 在50℃时紫外平均吸光度值最高，UVR=1.973（n=3）；图3D 表明，各超声时间下除10 min 外其他条件下紫外平均吸光度值基本差不多；图3E 表明，提取次数实验中， 槐米提取液在各区间的紫外平均吸光度值基本一样， 提取5次时紫外平均吸光度值最高，UVR=1.658（n=3）。

2.4.2 芦丁含量的单因素考察 分别从乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度、提取次数方面对槐米提取液中芦丁含量的变化进行考察。 见图4。

由图4A 可见， 芦丁的提取率先升高后降低，以60%乙醇浓度时为最高， 芦丁含量为188.1 mg/g （n=3），因此选择60%乙醇浓度。随着溶剂量的增加，在料液比1∶10～1∶30 之间芦丁的含量逐渐升高。 图4B 显示，当溶剂量超过30 倍量时，芦丁含量随着溶剂量的增加反而降低。 故选择料液比1∶30，此时芦丁含量最高，为189.0 mg/g（n=3）。 图4C 表明，芦丁在30～50℃的含量随温度的升高而增加， 而当温度进一步升高时，易引起芦丁结构的破坏和生物活性丧失，其含量反而略有下降。因此，选择超声温度50℃，芦丁含量为184.6 mg/g（n=3）。 由图4D 可见，在超声时间30 min左右芦丁的提取率最高。 超过30 min 后芦丁含量反而下降，超声时间过长可能使芦丁受到破坏。因此，选择超声时间为30 min，芦丁含量为191.1 mg/g（n=3）。由图4E 可见，提取2 次时芦丁的提取率最高，芦丁含量为177.1 mg/g（n=3）。

提取时温度越高，分子热运动越激烈，使溶剂与提取物分子间的传递加速， 有利于目标产物的溶出，有效成分的提取率就越高， 而超声时间决定生产周期，因此，它是工艺研究中一个十分重要的考察因素。由图4E 所示，在提取次数单因素试验中表明，多次提取会造成芦丁氧化从而使得芦丁含量下降，而且使得实验步骤过于繁琐，因此选择提取2 次为最佳。

2.5 正交试验考察

根据“2.4”项下的结果，超声波提取法中主要影响因素为乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）4 个因素。以四因素三水平建立因素水平表，并依此设计L9（34）正交表进行正交试验，见表1、2。

由表3 槐米紫外吸收方差分析所示，从方差比的大小可知，D＞A＞B＞C，影响槐米紫外吸收的主次因素顺序为超声温度＞乙醇浓度＞料液比＞超声时间， 超声温度差异有统计学意义（P ＜0.05），最佳提取条件为A3B2C2D3。由表4 芦丁的正交试验方差分析表明，从方差比的大小可知，D＞A＞B＞C，影响槐米中芦丁含量的主次因素顺序为超声温度＞乙醇浓度＞料液比＞超声时间，而其中超声温度、乙醇浓度和料液比差异均有统计学意义（P ＜0.05），最佳提取条件为A3B2C2D3。 综合上述结果，最佳提取条件为A3B2C2D3。

表1 提取芦丁影响因素与水平

图4 芦丁含量的单因素实验结果

表2 芦丁的正交试验结果

2.6 最佳工艺验证试验考察

取槐米0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，加入70%乙醇15 mL，在65℃下超声提取30 min，重复提取2 次。 在最佳工艺条件下重复实验3 次，分别测定槐米提取液的紫外吸收度、芦丁含量，取平均值，由表5 结果可知，槐米药材中芦丁的UVR 达到1.834，芦丁含量为198.63 mg/g ，该提取工艺稳定，提取率高。

表3 槐米紫外吸收方差分析

表4 芦丁提取方差分析

表5 优选提取工艺验证实验结果

3 讨论

3.1 槐米提取方法

中药槐米的提取方法一般有醇提法、 热水提取法、碱提酸沉法、超声波提取法等[10-11]。 超声波法具有提取时间短、操作简单、能避免高温对提取成分的影响等优点，最终采用超声波提取法制备槐米提取液。

3.2 槐米芦丁的防晒作用

槐米芦丁能增强和恢复血管壁的弹性，降低毛细血管的通透性，增强毛细血管的韧性，对皮肤有着较强的抗自由基氧化和抗辐射作用，对紫外线具有很强的吸收作用， 有明显的清除细胞活性氧自由基的作用，是目前较为理想的一种天然广谱防晒剂[12]。

3.3 太阳光中各波段紫外线作用

太阳光中的UVA 为长波紫外线，有强穿透力，能使皮肤干燥，加速表皮细胞中黑色素形成，使得肤色变黑[13]，这也是诱发皮肤癌的重要原因之一。UVB 为中波紫外线，中等穿透力，但对皮肤作用力最强，能使皮肤表皮细胞中的核酸或蛋白质变性， 长期或过量照射会使皮肤晒黑，并引起红肿和脱皮。 UVC 短波紫外线对皮肤的伤害最大，短时间内照射就能灼伤皮肤，长时间或高强度的照射还会诱发皮肤癌[14-15]。所以本研究在对槐米提取物的紫外各区间进行紫外吸收度的考察。

3.4 单因素考察试验

单因素考察试验表明，槐米提取液的紫外吸收值大小与芦丁含量高低成正比，这也说明槐米提取液的紫外吸收与其芦丁的含量有着密切的关系。 因此，笔者对它们同时进行了正交试验考察[16]。 紫外吸收方差分析结果表明，温度有显著差异。 芦丁提取方差分析结果显示，乙醇浓度、料液比和温度均有显著差异，两者最佳提取条件一致，这也表明了芦丁含量是考察槐米提取液紫外吸收能力的重要指标。最终选择优化条件为：称取适量槐米细粉，加入30 倍量的70%乙醇，超声温度65℃，超声30 min，重复提取2 次。 提取的芦丁含量可达198.63 mg/g。

本研究对槐米防晒成分芦丁的紫外吸收及其提取工艺进行了详细研究，对开发有关槐米防晒产品提供了实验依据，将会在今后研制防晒中药复方剂型的实验中进一步研究。

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