干细胞转录因子Sox2和Oct4在肺癌患者中的表达及临床意义

项保利 李琳琳 曹 亮 陈丽萍

1.河北北方学院附属第一医院呼吸内科，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院急诊科，河北张家口 075000

恶性肿瘤已成为当今危害人类生命的头号杀手， 全世界每年恶性肿瘤的致死人数超过1000 万人，死亡率列居疾病之首[1]。在各种类型的恶性肿瘤中，肺癌对人类的危害尤为显著，据统计近20 年肺癌的死亡率已位居肿瘤首位，对人类的健康和生存构成重大威胁[2]。随着研究的逐渐深入，越来越多的证据证明多种恶性肿瘤皆由一种具有自我更新能力的细胞诱导产生，这种细胞被称为“肿瘤干细胞”，这给恶性肿瘤的治疗提供了新的方向，人们期望以肿瘤干细胞为靶向治疗方法能够有效根除肿瘤，改善患者预后。Sox2、Oct4 是其中具有代表性的胚胎干细胞转录因子，两者的突变和异常表达与许多体内肿瘤有关[3]。 Oct4 是转录因子POU 家族中具有代表性的胚胎干细胞转录因子。该转录因子在胚胎干细胞、成人组织的祖细胞、胚胎生殖细胞、原发肿瘤、胚胎和生殖肿瘤细胞中表达。研究人员实验发现，该基因只表达于肿瘤细胞中，在正常的体细胞中则表达缺失，很自然地倾向于Oct4在肿瘤形成中发挥关键作用。 Sox2 是性别决定区因子，是遗传特性及保持胶质瘤祖细胞增殖的关键转录调节因子，存在于各类肿瘤中。 这两个基因共同参与基因调控网路，在胚胎形成和胚胎干细胞的多分化潜能及自我更新能力中发挥着重要作用。这些基因特异性的表达不在体细胞中，而在于人类生命周期的阶段中，因此对癌症治疗的潜力巨大。 近年来国内外研究对象多为细胞系，且研究方向主要为调节基因表达能力方面，对实体瘤方面的研究较少。 近年来各类研究成果指出，这两种因子在部分典型的肿瘤细胞系中有一定表达，并参与肿瘤的发生发展。 但关于在肺癌组织中是否有两种因子的表达及是否参与疾病进展与预后的各类问题目前尚无详细报道。本研究采用免疫组化生物学实验技术，检测肺癌组织中Sox2、Oct4的表达情况，并比较在各类型癌组织中两种因子表达水平的差异，分析其与肺癌的病理类型、临床分期、分化程度及其发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010 年1 月～2013 年12 月于河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）就诊的肺癌患者60 例，所有患者均经病理检查确诊。 其中男38 例，女22 例，年龄34～72 岁，平均（53.9±19.2）岁。依据2004 年WHO 制订的肺癌分类标准进行病理分型及分期，60 例患者中鳞癌30 例、腺癌20 例、小细胞癌5 例和大细胞癌5 例；TNM 分期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期9 例。所有患者均为首次发病且术前未进行化疗、放疗及免疫治疗。 另取我院同期经肺部手术切除并蜡块存档的正常肺组织20 例作为对照，均来自我院行健康检查且诊断结果为正常的健康者。包括男12 例，女8 例；年龄35～71 岁，平均（53.2±19.1）岁。 所有研究对象均为自愿参与并签署知情同意书，两组性别、年龄一般资料差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组化检测Oct4、Sox2 的表达

用4%多聚甲醛的固定组织标本，常规石蜡包埋，常规脱蜡，用水浴法修复抗原，用3%的双氧水抑制内源性过氧化物酶活性，封闭内源性非特异性抗原，加入Oct4、Sox2 多克隆抗体，4℃下过夜，滴加二抗，二氨基联苯胺（DAB）显色反应，用苏木精复染封片。 所用抗体均购自Abcam 公司，二抗试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3 结果判读及评分标准

光镜下进行观测，阳性反应：细胞核内发现有棕黄色、黄色或褐色颗粒。 依据查看到的阳性细胞所占比例及染色深浅评定阳性反应的强度。观察时按照视野中阳性细胞所占比例进行评分：百分比≤5%为0 分，＞5%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，在＞75%以上者为4 分。按照染色强度进行评分：不着色为0 分；淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。 最后按两种评分乘积分成阴性：0～2 分；阳性：3～12 分[4-6]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sox2、Oct4 在肺癌组织及正常肺组织中的表达情况

Sox2、Oct4 在20 例正常肺组织中表达均为阴性，在60 例肺癌组织中，Sox2 阳性28 例，阳性表达率为46.7%；Oct4 阳性43 例，阳性表达率为71.7%。 与正常组比较，差异有统计学意义（χ2=5.924，11.377；均P ＜0.05）。

2.2 肺癌组织中Sox2、Oct4 的表达与临床病理参数的关系

病理分期、病理类型与分化程度不同的肺癌组织中Sox2、Oct4 的阳性表达率比较差异均有统计学意义（P ＜0.05）；而不同年龄、性别的肺癌组织中Sox2、Oct4 的阳性表达率比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

2.3 肺癌组织中Sox2 与Oct4 表达的关系

Sox2 与Oct4 在肺癌组织中的阳性表达率比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。 见表2。

3 讨论

肿瘤的发生与很多原因有关，目前认为，恶性肿瘤是一种干细胞疾病，源自组织成体干细胞的恶性转化。研究证明[7]，肿瘤细胞与未分化的胚胎细胞都具无限增殖的能力、自我更新以及侵袭性，因此二者之间存在某些相似性，提示了在肿瘤细胞中也可能会出现某些胚胎干细胞因子。肺癌是当今世界上对人类生命健康威胁最大的恶性肿瘤，其具有较高的发病率及死亡率，目前对疾病发生发展的探索并寻求有效的治疗方法是医学界关注的热点。 肿瘤干细胞理论指出，肿瘤中存在一小群肿瘤的启动细胞，它们所具备的自我更新及抵抗治疗等特点是肿瘤治愈率低、治疗复杂且复发性高的根源。近年来人们对干细胞的研究较为深入，越来越多学者经研究证实了肿瘤起源于干细胞这一观点[8]。多数学者指出，干细胞的分子印迹决定着肿瘤的预后[9]。Oct4 与Sox2 是早期胚胎发育及细胞特征维持所必须的转录因子，在肿瘤的发生发展及消化道器官发育中发挥着重要作用。 另外，这两种因子还参与到中枢神经系统、呼吸道、泌尿生殖系统等各类肿瘤的发展过程当中。 它们在维持、调节肿瘤干细胞自我更新、侵袭力等特性方面均发挥着重要作用并逐渐成为研究肿瘤干细胞作用机制和防治的直接通道。为进一步支持这些理论，研究人员对肿瘤干细胞进行了Sox2 与Oct4 基因的敲除。结果显示，这些肿瘤启动细胞在去除二者后失去了自我更新、无限增殖及形成肿瘤的能力，最终导致肿瘤细胞的凋亡。 两者的突变和异常表达与许多肿瘤有关。这些基因表达的特异性与病理类型、临床分期、分化程度及其与肺癌发生发展的关系都需要进行进一步研究，其结果对肺癌的早期诊断及治疗有巨大的临床意义[10]。

表1 肺癌组织中Sox2、Oct4 的表达与临床病理参数的关系（n=60，例）

表2 肺癌组织中Sox2 与Oct4 表达的关系（n = 60，例）

Sox 基因家庭最早发现于小鼠体内，随后在鸟类、鱼类、哺乳类以及人类等生物体内发现大量该家族的基因片段。根据染色体的组成和基因序列的相似性可以将其分为10 个亚群。在早期胚胎的形成与发育、神经发育、性别形成、肿瘤发生等重要生物学过程中，所编码的蛋白起到不可替代的作用。该基因参与维持胚胎干细胞的多样性并在各类器官发育过程中发挥着重要作用，其中包括支气管的形成。 在肿瘤基因表达的研究中，通过分析分化中激活的基因结果表明，Sox2 在低分化的肿瘤中高表达，将该因子与Oct4 等转录因子共同转入成纤维细胞或肿瘤细胞后能够建立多能分化干细胞或多能分化肿瘤细胞。许多研究指出，Sox2 主要是通过参与调解复杂的转录因子网络以维持干细胞特性及肿瘤干细胞的抗凋亡特性[11]。因此，靶向Sox2 是治疗肿瘤的良好政策。 但尽管许多针对肿瘤组织的研究报道了该因子在前列腺、乳腺癌等方面的高表达且阐明Sox2 的发生对肿瘤发生的重要性但该因子在调控肿瘤发生的作用机制尚不完全清晰。 研究指出，在人与鼠的体细胞中将该因子与Oct4 等因子转入细胞后可使机体细胞发生多能干细胞转化。 而该因子与OCT4/NANOG 以及LIN28 这4 个因子的公转，可使人的体细胞发生多能干细胞化并具有胚胎干细胞的特性[12]。 ESCs 基因Oct4 也称Oct3/4，位于染色体的6p21.31 位置。该因子属于Ⅴ类POU 转录因子家族，由Pou5fl 基因码产生，最初发现于胚胎肿瘤细胞。后来发现该因子的表达严格局限于小鼠生命周期全程或多功能细胞中。 它与Sox2 等转录因子能对胚胎干细胞进行自我更新并保持胚胎干细胞的多潜能性，是生殖细胞和胚胎干细胞的标志物[13]。 目前可以确定的是，Oct4 作为公认的胚胎干细胞标志物，在卵母细胞、胚囊的内细胞团、早期分裂期胚胎、卵圆柱期胚胎的原始生殖细胞及原始外胚层中均有表达且随着细胞的不断分化，其表达水平会逐渐下调，说明它能够保持细胞发育中的多能性。 有研究显示，Sox2 在消化道肿瘤中表达量高，该表达因子对患者肿瘤组织的存在意义为促进细胞凋亡周期、抑制细胞生长。 而Oct4 最初发现于胃癌及胃溃疡等胃部疾病患者病灶组织中，该类患者病灶组织中Oct4 表达量较高，对癌症表达和预后密切相关，调控患者治疗及预后。 肺癌的发生起源是一个多因素、多阶段的过程，其发病机制较为复杂。 目前已经证明[14]，未分化的胚胎细胞与肿瘤细胞都有自我更新、无限增殖的能力及侵袭性。 近年来各类研究发现，Oct4 可表达于造血及间充质干细胞、胰岛、外周血、肠上皮、子宫内膜、脐带血、肺脏、甲状腺、肾脏及羊水和脐带血等组织的祖细胞[15-17]。 这些结果提示，Oct4 可能在胚胎组织、成体干细胞及胚胎癌组织里表达。 目前对该因子的分子调节机制研究较少，但部分研究发现，相对于生殖细胞及胚胎干细胞而言，该因子的表达会随着细胞的分化而下降[18]。 实验研究也指出，分化的滋养外胚层细胞比内细胞群Oct 表达低30 倍，其表达水平上调与下调分别与维持细胞多能性及细胞的分化有关。胚胎干细胞内Oct 的水平决定胚胎干细胞3 种不同命运，其表达水平保持在特定水平才能使胚胎干细胞处于不断自我更新的状态[19]。 当它的水平是正常的2 倍时，可分化为中胚层细胞和原始内胚层；当其表达水平降低至正常的1/2 时转为滋养层。 因此，其表达水平需保持在较窄范围内以维持细胞多能性的表型。 本研究结果显示，Sox2、Oct4 在20 例正常肺组织中表达全部为阴性，在60 例肺癌中，Sox2 阳性28例，阳性表达率为46.7%，Oct4 阳性43 例，阳性表达率为71.7%。 病理分期、病理分型与分化程度不同的患者Sox2、Oct4 的表达存在明显差异（P ＜0.05），而不同年龄、性别的患者Sox2、Oct4 的表达无明显差异（P ＞0.05），说明Sox2、Oct4 的表达会加速肿瘤细胞的转移和分化，对肿瘤的预后有严重影响。 研究认为肺癌的发生、发展与Sox2 与Oct4 密切相关，且通过协同作用共同促进肿瘤的发生与发展[13]，但对Sox2 和Oct4在肺癌组织中的交叉表达分析结果显示，两者并无明显相关性，由于作用机制尚未明确，尚不能排除它们之间的协同作用，需要有大量的后续研究进一步对其进行分析探索。

综上所述，Sox2 与Oct4 在肺癌组织中呈明显高水平表达，并与肿瘤的病理分型、分期及分化程度密切相关，因此Sox2、Oct4 可能在肺癌的发生、发展过程中起着重要的作用，在肺癌的诊断及预后评价中有着重要意义。

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