心肌纤维化的表观遗传调控进展

李龙 杨水祥

心肌纤维化的表观遗传调控进展

李龙 杨水祥

1 引言

大多数心脏疾病都与心肌纤维化有关。心肌纤维化即心肌瘢痕形成的过程，它的特点是成纤维细胞的积累和细胞外基质（ECM）蛋白的过度沉积，从而导致器官的结构畸形和功能改变[1]。值得注意的是，心肌成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），似乎能分泌大量细胞因子、生长因子、ECM蛋白，从而在纤维化发病中起主要作用[2]。过量的胶原产生并沉积在心脏，导致了心肌纤维化。心肌成纤维细胞是心肌纤维化的主要决定因素，激活的心肌成纤维细胞是ECM的主要来源。目前认为，一些调节因素也对纤维化有实质性的影响。心肌纤维化同时影响心肌收缩和舒张，损害心肌细胞的电耦联，是导致心力衰竭、致死性心律失常和猝死的重要病理基础。因此，心肌纤维化的防治是治疗各种心脏疾病的重要目标。然而现在并没有治疗心肌纤维化的有效方案，这很大程度上是因为心肌纤维化的潜在机制仍不清楚。

表观遗传学讨论的是可遗传的基因改变，这种改变不是归结于DNA序列的改变，而是由于遗传信息翻译或组装的改变所导致。这些基因表达的改变具体是通过DNA链三级结构的变化和影响基因表达分子的改变来实现的[3]。表观遗传学重要的改变包括DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA（miRNA）表达调控。这些基因修饰导致了相同基因的不同表达，这是周围的环境改变所导致的基因增强或沉默。

最近的证据表明，TGF-β1、血管紧张素Ⅱ可能同时在固有的成纤维细胞分化中起着关键的作用。人们已经证实很多基因与心肌纤维化有关。基因表达的变化涉及到大量的基因，以及不同基因表达的顺序改变等。表观遗传调控在心肌成纤维细胞的活化和增殖阶段，和在转录因子识别表观遗传调控信号并传达基因表达信息的过程中发挥着重要作用。新的数据表明，这些表观遗传修饰同样影响心肌纤维化的进展。

但是，目前对引起心肌纤维化的表观遗传改变的机制和信号了解得还很少。本文主要介绍表观遗传改变机制（如DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调控）与心肌纤维化的研究进展。

2 DNA甲基化和心肌纤维化

DNA甲基化在表观遗传中起着重要的作用，它包括基因组印记、X染色体失活、基因沉默等。哺乳动物的DNA中胞嘧啶及胞嘧啶鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的5号碳原子可以甲基化。CpG二核苷酸遍及整个基因组，大量的甲基化可妨碍这些位点的基因转录。这些CpGs往往集中在基因组中300～3000碱基的DNA片段内，称CpG岛[4]。大多数CpG岛都是转录起始位点。CpG岛估计占人类基因启动子的50%～70%，基因启动子CpG岛甲基化与基因沉默相关。CpG岛也存在于基因之外，主要是在相对保守的基因区间。这些CpG岛的功能没有得到很好的发现[5]。因为两种CpG岛启动子的甲基化模式相似，人们怀疑它们可能是远端调控区及增强子的一部分。

DNA甲基化由至少三种不同的DNA甲基转移酶（DNMTs）催化：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。现主要认为DNMT1是一个维持性DNMT，对半甲基化DNA具有巨大的特异性，维持复制过程中的DNA甲基化模式[6]；认为DNMT3A和DNMT3B是从头甲基转移酶[7]。尽管DNA甲基化酶已经被广泛认识，人们却很少了解DNA甲基化的过程。DNA甲基化酶介导胞嘧啶的甲基化，使甲基基团从甲基供体S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶的五号碳原子上。CpG岛胞嘧啶的甲基化，通过阻止转录因子到DNA顺式元件与基因启动子结合区域的结合，来抑制转录。在这一过程中，甲基化CpG二核苷酸的甲基基团插入DNA双螺旋间沟内[8]。正常组织中CpG岛甲基化允许基因转录的发生，然而在纤维化过程中，CpG岛DNA异常甲基化的出现阻碍了重要基因的翻译。DNA的甲基化会干预转录因子接近和招募它们的DNA结合区，这种机制导致了甲基化基因的转录沉默[9]。最近发现一种甲基CpG结合蛋白家族能特异性地结合甲基化标志物，通过招募组蛋白修饰蛋白从而抑制转录。这些甲基CpG结合蛋白能够招募大量蛋白复合物，这些复合物又通过改变染色体结构来控制DNA转录[10]。

心肌成纤维细胞增殖的表型改变和表型特征可以用暴露于恶劣环境条件来解释。硒缺乏导致了反应性心肌纤维化和收缩功能障碍，并伴随着心肌氧耗的增加。而补充硒会显著降低DNA甲基转移酶的活性和DNA甲基化的发生。这些结果表明，硒缺乏和适度补硒通过影响DNA甲基化平衡来调节心肌纤维化[11]。这表明激活的DNA甲基化过程可能有助于心肌纤维化。

3 组蛋白修饰和心肌纤维化

在DNA转录期，组蛋白修饰使基因组处于“激活状态”或称常染色质，此时DNA可转录，而处于“非激活状态”或异染色质时DNA不可转录[12]。组蛋白修饰是通过不同的酶催化的，包括甲基化酶、乙酰化酶、磷酸化酶等。虽然有许多不同类型的翻译后修饰，但这里将重点讨论研究最多的两个组蛋白修饰，即组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化。

组蛋白乙酰化是一个动态过程，调节组蛋白乙酰化酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）两大家族的拮抗活性，达到动态平衡[13]。HDACs分为四类：Ⅰ类（HDAC1-3、HDAC8）、Ⅱ类（HDAC4-7、HDAC 9-10）、Ⅲ类去乙酰化酶（SIRT1-7）和Ⅳ类（HDAC11）。一般说来，组蛋白的乙酰化与基因的转录激活有关，而组蛋白去乙酰化与基因阻遏和沉默有关[14]。

不同的是，赖氨酸甲基化可历经多次的修饰出现三种不同的状态（一甲基化、二甲基化和三甲基化的赖氨酸）。不同组蛋白的甲基化、组蛋白赖氨酸甲基化或精氨酸残基甲基化对基因表达有不同的影响结果[15]。例如，组蛋白H3（H3K4me3）上的三甲基化通常与转录激活有关，而 H3K9me3和H3K27me3与异染色质介导的基因沉默有关。这些修饰是由组蛋白甲基转移酶（HMTS）来介导的，它动态地充当组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶[16]。

为了进一步研究组蛋白修饰对心肌纤维化的反应，可使用化学抑制剂单独抑制组蛋白乙酰化酶（HAT）或组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性。HDAC对心肌纤维化模型的炎性损害作用已被发现[17]。自发性高血压大鼠，使用丙戊酸治疗20周会减少LED IL-1β和TNF-α的表达，这与心肌肥厚和纤维化的抑制和心脏功能的改善有关。HDAC抑制剂对病理性心肌纤维化有较大的抑制作用：HDAC抑制剂会抑制其他信号介质（例如，ERK、Akt、PI3K）来影响胶原合成，TSA阻断了TGF-β1介导的体外培养大鼠心室成纤维细胞的胶原合成。HDAC抑制剂通过抑制α-SMA的表达阻断分化的成纤维细胞转为收缩的肌成纤维细胞[18]。

据报道，组蛋白乙酰化是AngⅡ诱导的IGF-ⅡR基因表达所必需的。此外，染色质免疫沉淀分析表明，乙酰化组蛋白H3和H4与AngⅡ诱导的IGF-ⅡR启动子增强有关。总之，这项研究表明，组蛋白乙酰化在病理性心肌纤维化IGF-ⅡR的上调方面起着关键作用[19]。

染色质免疫沉淀分析表明，TGF-β1β的治疗增加了Smad2/3、Smad4和组蛋白去乙酰化酶1的结合，还增加了乙酰化组蛋白3和心肌成纤维细胞中PPARγ启动子的结合[20]。这些数据强有力地证明，TGF-β1β通过转录机制直接抑制了心肌成纤维细胞中PPARγ的表达。一项有关利钠肽受体a介导的心肌肥厚纤维化的研究中，Ellmers等[21]证实，利钠肽受体a基因敲除小鼠晚期HDAC7a mRNA的表达增加。

此外，组蛋白修饰可能导致转录激活或抑制最近的研究证实，HDAC过度表达也会引起心房纤维化、缝隙连接蛋白40表达下调和转基因小鼠的房性心律失常易感性增加，证实HDAC抑制有害的心房重构。经TSA处理后减少了心房纤维化，恢复了连接蛋白40的表达和分布。目前，组蛋白甲基化转移酶（EZH2）编码H3K27 HMT，在心脏前体，EZH2表达缺失导致心肌肥厚和纤维化[22]。总之，这些结果清楚地表明，组蛋白修饰在心肌纤维化中发挥关键作用。

4 M icroRNA和心肌纤维化

MiRNA是一种非编码小RNA（约22个核苷酸），通过转录后mRNA的降解或者抑制蛋白质翻译来抑制基因的表达。MiRNA为基础的机制与其他表观遗传修饰构成了非编码RNA的协调性活动，如DNA甲基化和转录后组蛋白修饰。MiRNA分子调控大量的生物学过程，如发育、细胞存活、增殖等等[23]。多种病理过程已经发现miRNA的异常表达，如心肌纤维化。MiRNA在衰竭的心肌中有不同的表达，通过靶向支配心脏重塑的基因影响心衰的进程。所以miRNAs从根本上参与和影响心肌纤维化，另外，miRNA已被证实能控制心肌成纤维细胞的分化。

最近的研究表明，来源于内皮间质转移体（EndMT）的成纤维细胞样细胞，通过合成miR-24前体上调miR-24，减少了纤维化和心肌成纤维细胞的分化和迁移。TGF-β增加了miR-24的表达，过表达的miR-24进一步减少了TGF-β的分泌和心肌成纤维细胞Smad2/3的磷酸化。此外，Shyu等认为，添加外源TGF-β1增加了大鼠心肌成纤维细胞miR-208a的表达。过表达的miR-208a上调了内皮素和Ⅰ型胶原蛋白的表达，相反，通过心肌拉伸，miR-208a和Smad3/4的减少抑制了内皮素和Ⅰ型胶原蛋白的表达[24]。Castoldi等[25]认为，下调的miR-133a和miR-29b通过调控Ⅰ型胶原的表达调节血管紧张素Ⅱ依赖性高血压的心肌纤维化。慢性房颤间质纤维化中miR-30和miR-133表达下调。另外，mir-18/19调控改变了ECM蛋白CTGF、TSP-1和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的水平。在心脏老化的过程中，mir-18/19的减少、CTGF和TSP-1水平的增加提示有心衰的可能。

Bernardo等[26]研究表明，整个miR-34家族的沉默可以保护心脏从而对抗病理性心肌重塑和纤维化形成，这与Akt活性上调有关。抑制miR-34a能减少急性心梗后心肌纤维化，并促进心肌功能的恢复。生物信息学分析表明，MMP9是miR-132的靶标，MMP16是mir-146b的靶标，TIMP3是miR-181b的靶标，这些miRNAs在心肌纤维化中可能发挥潜在的作用[27]。

事实上，体外和体内下调miR-29或拮抗miRNAs会减少胶原蛋白的表达，随后发现MMP-2是miR-29a体外的唯一靶标。过表达的TGFβRⅢ能抑制miR-21的表达，从而减少心肌成纤维细胞胶原的产生。小鼠心肌过表达miR-21与压力负荷引起的心肌纤维化有关。这项研究支持miR-21作为纤维化过程的调节点，并强调循环中miR-21作为心肌纤维化标志物的价值[28]。在体内，小鼠压力负荷引起的心脏疾病模型中沉默miR-21降低了ERK-MAPK活性，抑制了间质纤维化。TGF-β介导的EndMT至少部分由miR-21介导的PTEN/Akt信号通路调节。在病理性心肌肥大中，增强的PI3Kα信号保护转录组的识别，同时TGF-β/miR-21的调控增强了PI3K信号防止心肌纤维化[29]。MiR-21促进心外膜间皮细胞向上皮的转变，miR-21通过下调sprouty-1（一种抑制成纤维细胞增殖的蛋白质）从而导致心室纤维化性重构。心房敲除miR-21能抑制心房纤维化和房颤的发生。MiR-22的过表达促进细胞衰老和心脏成纤维细胞的迁移，衰老的心脏miR-22的下调至少加速了心肌成纤维细胞的衰老和抑制了它们的迁移。这种机制也可能在抑制心肌纤维化方面发挥关键作用[30]。

5 总结和展望

心肌纤维化过程中基因表达的表观遗传调控的证据仍不很充分。表观遗传介导的DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA作为有害环境刺激中产生的分子底物会导致心肌纤维化。未来表观遗传改变可成为药物或基因手段所干预的靶点。如甲基化剂5-氮-2-脱氧胞苷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA已被用于这方面的研究[31]。此外，未来的研究将会在分子水平上提供更详细的信息，为表观遗传修饰直接影响心肌纤维化提供更确切的证据。

［1］Elnakish MT，Kuppusamy P，Khan M.Stem cell transplantation as a therapy for cardiac fibrosis.JPathol，2013，229：347-354.

［2］Herum KM，Lunde IG，Skrbic B，et al.Syndecan-4 signaling via NFAT regulates extracellular matrix production and cardiac myofibroblast differentiation in response to mechanical stress.J Mol Cell Cardiol，2013，54：73-81.

［3］Yu Z，Gaerig V，Cui Y，et al.Tertiary DNA structure in the single-stranded hTERT promoter fragment unfolds and refolds by parallel pathways via cooperative orsequential events.J AmChem Soc，2012，134：5157-5164.

［4］Tan J，Gu Y，Zhang X，et al.Hypermethylation of CpG islands is more prevalent than hypomethylation across the entire genome in breast carcinogenesis.Clin Exp Med，2013，13：1-9.

［5］Koerner MV，Pauler FM，Hudson QJ，et al.A downstream CpG island controls transcript initiation and elongation and the methylation state of the imprinted Airn macro ncRNA promoter.PLoS Genet，2012，8：e1002540.

［6］Malik G，Dangwal M，Kapoor S，et al.Role of DNA methylation in growth and differentiation in Physcomitrella patens and characterization of cytosine DNA methyltransferases. FEBS J，2012，279：4081-4094.

［7］Clements EG，Mohammad HP，Leadem BR，et al.DNMT1 modulates gene expression without its catalytic activity partially through its interactions with histone-modifying enzymes.Nucleic Acids Res，2012，40：4334-4346.

［8］Plitta B，Adamska E，Giel-Pietraszuk M，et al.New cytosine derivatives as inhibitors of DNA methylation.Eur JMed Chem，2012，55：243-254.

［9］Schoofs T，Rohde C，Hebestreit K，et al.DNA methylation changes are a late event in acute promyelocytic leukemia and coincide with loss of transcription factor binding.Blood，2013，121：178-187.

［10］Zou X，Ma W，Solovyov IA，et al.Recognition of methylated DNA through methyl-CpG binding domain proteins.Nucleic Acids Res，2012，40：2747-2758.

［11］Metes-Kosik N，Luptak I，Dibello PM，et al.Both selenium deficiency and modest selenium supplementation lead to myocardial fibrosis in mice via effects on redox-methylation balance.Mol Nutr Food Res，2012，56：1812-1824.

［12］Shi YB，Matsuura K，Fujimoto K，et al.Thyroid hormone receptor actions on transcription in amphibia：The roles of histone modification and chromatin disruption.Cell Biosci，2012，2：42.

［13］Graff J，Tsai LH.Histone acetylation:molecular mnemonics on the chromatin.Nat Rev Neurosci，2013，14：97-111.

［14］Duque-Afonso，J Yalcin A，Berg T，et al.The HDAC class I-specific inhibitor entinostat（MS-275） effectively relieves epigenetic silencing of the LAT2 gene mediated by AML1/ETO. Oncogene，2011，30：3062-3072.

［15］Li J，Zhou F，Zhan D，et al.A novel histone H4 arginine 3 methylation -sensitive histone H4 binding activity and transcriptional regulatory function for signal recognition particle subunits SRP68 and SRP72.J Biol Chem，2012，287：40641-40651.

［16］Shyh-Chang N，Locasale JW，Lyssiotis CA，et al.Influence of threonine metabolism on S-adenosylmethionine and histone methylation.Science，2013，339：222-226.

［17］Cao DJ，Wang ZV，Battiprolu PK，et al.Histone deacetylase（HDAC）inhibitors attenuate cardiac hypertrophy by suppressing autophagy.Proc Natl Acad Sci U SA，2011，108：4123-4128.

［18］McKinsey TA.Targeting inflammation in heart failure with histone deacetylase inhibitors.Mol Med，2011，17：434-441.

［19］Chu CH，Lo JF，Hu WS，et al.Histone acetylation is essential for ANG-Ⅱ-induced IGF-ⅡR gene expression in H9c2 cardiomyoblast cells and pathologically hypertensive rat heart.J Cell Physiol，2012，227：259-268.

［20］Gong K，Chen YF，Li P，et al.Transforming growth factorbeta inhibits myocardial PPARgamma expression in pressure overload-induced cardiac fibrosis and remodeling in mice.J Hypertens，2011，29：1810-1819.

［21］Ellmers LJ，Scott NJ，Piuhola J，et al.Npr1-regulated gene pathways contributing to cardiac hypertrophy and fibrosis.JMol Endocrinol，2007，38：245-257.

［22］ Delgado-Olguin P，Huang Y，Li X，et al.Epigenetic repression of cardiac progenitor gene expression by Ezh2 is required for postnatal cardiac homeostasis.Nat Genet，2012，44 343-347.

［23］Glasmacher EH，Oefig KP，Vogel KU，et al.Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nat Immunol，2010，11：725-733.

［24］Pan Z，Sun X，Shan H，et al.MicroRNA-101 inhibited postinfarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via the FBJ osteosarcoma oncogene/transforming growth factor-beta1 pathway.Circulation，2012，126：840-850.

［25］Castoldi G，Di Gioia CR，Bombardi C，et al.MiR-133a regulates collagen 1A1:potential role of miR-133a in myocardial fibrosis in angiotensinⅡ-dependent hypertension.J Cell Physiol，2012，227：850-856.

［26］Bernardo BC，Gao XM，Winbanks CE，et al.Therapeutic inhibition of the miR-34 family attenuates pathological cardiac remodeling and improves heart function.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109：17615-17620.

［27］Jiang X，Ning Q，Wang J.AngiotensinⅡinduced differentially expressed microRNAs in adult rat cardiac fibroblasts.J Physiol Sci，2013，63：31-38.

［28］ Villar AV，García R，Merino D，et al.Myocardial and circulating levels ofmicroRNA-21 reflect left ventricular fibrosis in aortic stenosis patients.Int JCardiol，2013，167：2875-2881.

［29］Thum T，Gross C，Fiedler J，et al.MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts.Nature，2008，456：980-984.

［30］Bronnum H，Andersen DC，Schneider M，et al.MiR-21 promotes fibrogenic epithelial-to-mesenchymal transition of epicardial mesothelial cells involving Programmed Cell Death 4 and Sprouty-1.PLoSOne，2013，8：e56280.

［31］Cardin S，Guasch E，Luo X，et al.Role for MicroRNA-21 in atrial profibrillatory fibrotic remodeling associated with experimental postinfarction heart failure. Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，5：1027-1035.

Research progress on epigenetic regulation ofmyocardial fibrosis

心肌纤维化； 表观遗传调控； miRNAs

Myocardial fibrosis； Epigenetic regulation； MiRNAs

100038 北京市，北京大学第九临床医学院北京世纪坛医院心内科

杨水祥，E-mail：sxyang68@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．12．003

R542.2+3

A

1672-5301（2015）12-1066-04

2015-08-26）