三氧化二砷诱导线粒体途径细胞凋亡机制的研究进展

李 丹 宋婷婷 刘伟华 谢坤霞 王晶晶 肖延风

西安交通大学第二附属医院儿科，西安 710004

三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）又名信石、砒霜等，1998年第一次报道其对于复发或难治性急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leuketnia，APL）能达到诱导期完全缓解，并且无骨髓抑制作用[1]。此后，ATO 对于多种血液系统恶性肿瘤具有治疗作用的报道越来越多，并且作为治疗APL 的新药先后通过了中国国家药品监督管理局及美国FDA 的审批[2]。ATO可治疗血液系统疾病，对多种恶性实体瘤也有强大的抗癌作用。许多化疗药物都是通过干涉肿瘤细胞的凋亡作用达到抗肿瘤的目的，ATO 作为一种已经使用几个世纪的传统药物，也是通过诱导肿瘤细胞的凋亡来发挥作用的，但具体机制尚未明确，近年来ATO 和线粒体途径凋亡信号通路的关系研究成为热点，本文回顾了大量文献，就此问题的研究进展进行阐述。

1 细胞凋亡

凋亡信号通路主要有3 类：线粒体途径（内在通路，intrinsic pathway）、死亡受体途径（外在通路，extrinsic pathway）和内质网途径。在死亡受体途径中，部分配体如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Fas配体（也称为CD95L）、TNF-相关的凋亡诱导配体或TNF配体超家族成员10（TNF SF10）分别与死亡受体1（TNF受体，TNFR1）、Fas（也称CD95）、死亡受体4（DR4，也称TRAIL 受体1）或DR5（也称为TRAIL2）相互作用。这些相互作用最终导致Fas 关联的死亡结构域（Fas associated death domain，FADD）的募集和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Caspase 8）的活化。此后经过两种途径发挥凋亡作用，第一通过Caspase 信号通路传递凋亡信号；第二，线粒体膜电位的消失，线粒体膜通透性增高，细胞色素C 释放，并与凋亡Caspase 活化因子（apoptotic protease activating factor，Apaf-1）、Caspase 9 前体及ATP/dATP 形成凋亡体，然后召集并激活Caspase 3，进而引发Caspase 级联反应，导致细胞凋亡[3]。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可启动细胞凋亡。多种生理和病理条件，如缺氧、钙离子平衡失调等，内质网内钙离子平衡受到破坏，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网累积，将会导致内质网内钙离子失衡，增加了细胞内钙离子浓度，触发了细胞凋亡。

在线粒体途径中，任何因素导致的ATP 降低、活性氧的产生及胞质内钙离子浓度升高，均可使线粒体内膜腺苷转位酶的构象发生改变，引起线粒体转换孔的开放，使得线粒体跨膜电位降低或消失，细胞色素C 从线粒体膜间隙释放出来，它同ATP/dATP 一起与Apaf-1、Caspase 9 前体相互作用形成凋亡小体，从而募集和活化Caspase 9，导致下游的Caspase 的活化和死亡应答[4]。在线粒体途径中p53、Bcl-2 家族、凋亡抑制蛋白家族均为重要的细胞凋亡调节因子，NF-κB 通过对以上蛋白基因转录的调节间接地参与细胞凋亡的过程。

2 ATO 和细胞凋亡

ATO 是一种以线粒体为作用靶点的药物，能够结合腺苷核苷转运蛋白，干扰线粒体的呼吸。与大多数的化疗药物一样，其可以诱发线粒体凋亡通路。这条通路的特点为细胞色素C 的释放及其他线粒体蛋白的释放，集合及激活凋亡体，抑制凋亡抑制调节蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs），接下来激活Caspases 9 及其他的效应Caspase。ATO 潜在的毒性在于和肿瘤坏死因子家族的结合，激活外源性凋亡途径。这条途径由细胞因子绑定和激活死亡受体，形成Fas 关联的死亡结构域的募集及Caspase 8 的裂分和活化下游的Capase 3。内质网应激诱发的凋亡通路和线粒体及死亡受体通路完全不同。ERS 激活信号级联反应，同时激活其各自的信号传导通路，触发了未折叠蛋白效应（unfolding protein response，UPR）。过度的内质网应激损伤了内质网的功能，激活了凋亡信号通路。

3 ATO 与线粒体途径诱发凋亡的关系

3.1 ATO 与活性氧的关系

活性氧化物指的是细胞内一类有活性的含氧物质。继往文献报道指出，ATO 可通过细胞膜弥散到细胞质中，通过产生活性氧类物质产生细胞毒性作用。也有报道指出，ATO 在白血病细胞系及其他实体肿瘤细胞系中均能产生氧化应激及细胞死亡。但具体机制尚未明确。Kumar 等[5]研究表明，在HL-60 细胞系中ATO 主要通过产生ROS、增加线粒体膜蛋白和脂质双分子层过氧化反应、诱导DNA 损伤及减少还原型谷胱甘肽的浓度等途径导致氧化应激，使得线粒体通透性增加，细胞色素C 从线粒体释放，激活Caspase 系统产生细胞凋亡。Jiang 等[6]在对比ATO 和亚砷酸盐在诱发A549 细胞系中氧化应激、基因毒性及细胞凋亡过程中的差别时发现，ATO 产生了更多的活性氧，超氧化物歧化酶浓度更低，细胞内还原性谷胱甘肽更低。故指出ATO 的诱发肿瘤细胞凋亡的机制中有活性氧的产生，其或许能解释为何ATO 具有抗癌作用，二亚砷酸盐却具有致癌作用。

3.2 ATO 与BCL-2 家族

Bcl-2 家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白中，包含3 个BH 结构域（BH1，BH2，BH3）的Bak、Bok 和Bax，2 个BH 结构域的Bcl-Xs 以及只含有1 个BH 结构域的Bad、Bid、Bim、Bik、Hrk、Bnip3、Nix、Puma、Bmf、Noxa 等；另一类为抗凋亡蛋白，包含4 个BH 结构域（BH1、BH2、BH3 及BH4）的Bcl-2、Bcl-XL，Bcl-W、Al/Bfl-1、Boo 和含有3 个BH 结构域（BH1、BH2、BH3）的Mcl-1 等。这两类蛋白的相互作用影响对方的功能。BCl-2 家族对线粒体膜通透性的改变至关重要，目前有三种假说解释。①直接激活：Bcl-2 导致线粒体外膜通透性增加，在正常细胞中，BH3-only 家族蛋白无活性，或被家族中抗凋亡蛋白绑定而失去活性，当细胞接受凋亡信号后，BH3-only蛋白凋亡执行蛋白通过转录、翻译或移位被激活，使其在线粒体外膜打孔，钙离子外流，诱导细胞凋亡，此假说中抗凋亡蛋白通过直接绑定凋亡执行蛋白行使功能，而不是直接与Bak、Bax 结合起作用。②假定Bak、Bax 在胞浆内具有活性，与抗凋亡蛋白结合后，活性被抑制，接受凋亡刺激后，BH3-only 蛋白竞争性结合抗凋亡蛋白，使Bak、Bax 游离，发挥促凋亡活性。③接受凋亡信号后，BH3-only 凋亡蛋白与抗凋亡蛋白结合，中和其结合BH3-only 凋亡执行蛋白及Bak、Bax 的能力[7]。

线粒体外膜的通透性受多种因素的控制，包括Bcl-2 家族（促凋亡、抗凋亡蛋白），Bcl-2 蛋白的基因调节及翻译后修饰能够使肿瘤细胞免予凋亡。在滤泡性淋巴瘤中，Bcl-2 原癌基因转移到免疫球蛋白重链的基因座上，导致了Bcl-2 转录的异常激活及高表达。除了基因的改变，经由生存前路径如PI3K/Akt/mTOR或tRas/MEK/ERK 通路，能够通过磷酸化调节Bcl-2家族蛋白的表达或活性[8]。

目前多项研究指出，ATO 诱导的肿瘤细胞凋亡途径包括Bcl-2 的磷酸化、Caspase 2 的活化和聚合酶裂解片段有关，Bcl-2 的磷酸化导致了Bcl-2 和Bax异质二聚体的解离，并诱导产生Bax 和Bax 的异质二聚体产生，其可诱导促使线粒体释放细胞色素C，细胞色素C 引发Caspase 级联反应，促进了细胞的凋亡[9]。Ai 等[10]研究表明，应用ATO 处理胆囊癌细胞能够诱发肿瘤细胞的凋亡，细胞调亡的程度与ATO 的浓度和作用时间有关，而且ATO 在mRNA 的水平可以下调Bcl-2 的表达；另外，应用ATO 处理过度表达Bcl-2蛋白的胆囊癌细胞后，凋亡细胞的数量会大量减少，表明Bcl-2 参与ATO 诱发的肿瘤细胞凋亡。ATO 还可以促进促凋亡蛋白Bax 表达增多，抑制抗凋亡Bcl-XL。Kim[11]等在正常的睾丸支持细胞中发现经过ATO处理后诱发了细胞的凋亡，且伴随有Caspase 3 的活化，Bcl-2 及其他凋亡抑制蛋白下调，以及Bax 的上调。Zekri 等[12]从转录水平上也证实ATO 调高Bax 的水平，降低了Bcl-2、生存素等抗凋亡蛋白基因水平。Bcl-2 和Bax 之间的比例平衡，决定了细胞是凋亡还是存活的命运。综上所述，ATO 通过调节Bcl-2 家族来诱发细胞的凋亡。

3.3 ATO 和p53

细胞的生长和死亡通常由原癌基因和肿瘤抑制基因的相互平衡决定。在许多肿瘤中均存在生存素的过渡表达和p53 功能的丧失。Shao 等[13]研究表明，生存素存在时，p53 的构象会发生直接变化，Zhang 等[14]研究表明，对于B 淋巴细胞型急性淋巴细胞白血病细胞系来说，p53 绑定在生存素启动子上，抑制了生存素的转录，ATO 激活了p53，促进了细胞凋亡。对转染p53 siRNA的抑制，可以阻止由ATO 导致的生存素的下调。

部分文献指出，在一些细胞系中ATO 诱发的细胞周期的停滞与p53 的增加有关，但也有文献证实，暴露于ATO 后一些细胞系中p53 蛋白逐渐消失，并且和G1或G2/M 期的细胞周期停滞同时发生。在哪个细胞周期发生停滞与p53 的状态有关，表达野生型p53的细胞发生G1期停滞，表达突变型p53 在G2/M 期停滞[15]。对于ATO 的反应，表达突变型p53 的细胞似乎比野生型细胞更敏感。p53 似乎对于ATO 诱发的DNA 损伤具有保护作用。有文献[14]指出，TM4 细胞经过ATO 处理后p53 蛋白逐渐下降，p53 的下调可能和人类双微体（human double microbody，HDM2）有关，HDM2 可能引起p53 的无用性下调。

3.4 ATO 激活Caspase 依赖的细胞凋亡

Caspase 家族共有11 种，包括Caspase 1-10 以及14，分为凋亡相关性和炎症相关性Caspase 蛋白，凋亡相关性Caspase 再分为起始相关性（2，8，9，10）和效应相关性Caspase 两类（3，6，7）。Caspase 最终的效应蛋白为Caspase 3，有活性的Caspase 3 是从30 kD的酶原上的17 和12 kD 的亚基组成的同源二聚体获得，它的作用是主要有裂解多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]，终 止DNA 修复；活化核酸内切酶，特异性切割核小体之间的连接序列，DNA 断裂成180～210 bp 大小的片段；破坏细胞骨架蛋白，细胞外基质蛋白、核蛋白等，使细胞失去正常的形态[3]。其他研究也证实了Caspase 3 在化疗药物诱发凋亡中的作用，苯丙烯酸通过激活Caspase 3 及DNA 损伤导致凋亡[15-16]，黄芪通过DNA 断裂、凋亡调节剂Caspase 3 蛋白表达诱发凋亡[17]。Kumar 等[5]研究表明，ATO 以一种浓度和时间依赖的方式激活Caspase 3。不仅在肿瘤细胞，在正常的豚鼠心肌纤维细胞中也发现，当ATO 浓度达到2～10 μmol/L 时，会出现TGF-1 和p-ERK 蛋白的表达Bax/Bcl-2 的比例增加，以及Caspase 3 的活化[18]。

3.5 ATO 提高细胞内钙离子浓度

钙离子浓度的体内平衡是维持正常细胞功能的重要机制。钙离子可能在调节细胞凋亡的过程中发挥中心作用。ATO 诱发的细胞凋亡和细胞内钙离子浓度的增加有关。具体机制尚未清楚，现在认为砷剂可以阻止某些酶的活性，诱导DNA 断裂、影响一些基因如Bcl-2、c-myc 和p53 的表达，这些因子和钙离子一起在细胞的凋亡过程中发挥重要的作用。钙离子浓度增高后，各种钙离子依赖的降解酶如磷脂酶、Caspase 以及内切酶，活性被激活。ATO 诱发的细胞内钙离子浓度升高的机制为从细胞内钙储存库中释放钙。ATO 对细胞内钙离子浓度的影响程度与基础的钙浓度有关，即基础钙浓度越低，钙离子增高的越明显。不同细胞系对于ATO 的反应不同，或许是因为不同细胞系钙离子基础浓度不同[19]。Cai 等[20]研究证实，经过ATO 处理骨髓间充质肝细胞后，Caspase 3 的活性被激活，凋亡细胞的数量增加，且ATO 可以诱发细胞内钙离子浓度增加，使用细胞内钙离子螯合剂四乙酸后能明显减轻ATO 导致的细胞内钙离子浓度增加。故认为ATO 导致的细胞凋亡除与Caspase 3 的激活有关外，也和细胞内钙离子浓度的增加有关。

3.6 ATO 活化或开放线粒体PTP

在被诱导产生特征性形态学改变和DNA 降解前，凋亡细胞一个基本的变化是线粒体膜功能的改变即线粒体的通透性改变。主要通过位于线粒体内、外膜之间的一组蛋白复合体，即线粒体通透性转运孔（permeability transition pore，PTP）来调节其通透性。PTP 复合体由位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道、位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转运蛋白以及亲环素组成[21]，正常情况下，PTP 处于低电压状态；凋亡过程中，三磷酸肌醇介导内质网钙释放，致使线粒体钙超载，PTP 转为高电压状态并开放，这种转换是不可逆的，且与钙和PTP 结合位点的饱和度密切相关，阴离子通道的开放，造成水和离子在胞质与线粒体基质间自由扩散，线粒体膜电位瓦解，氧化磷酸化解偶联，线粒体肿胀，最终导致线粒体外膜破裂，膜间隙内物质释放。ATO 与腺嘌呤核苷酸转位蛋白结合，形成二硫键，导致线粒体通透性转运孔开放，线粒体跨膜电位下降或消失，呼吸链偶联及谷胱甘肽耗竭，ROS 产生及细胞色素C、细胞凋亡诱导因子的释放。

3.7 ATO 对凋亡抑制蛋白的影响

凋亡抑制蛋白家族是细胞自身调节的重要因子，参与炎症反应、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞分裂等多种生物过程。在人类的8 种IAPs 中，XIAP、cIAP1、cIAP2，Survivin 和ML-IAP 主要参与细胞内各种信号网络传导，包括肿瘤坏死因子超家族、转化生长因子、分裂原活化Caspase 及氨基末端激酶。IAPs以存在1-3 个保守的IAP 重复序列（baculoviral IAP repeat，Bir），除了Bir 结构域外，还有一些IAPs 具有碳末端环形结构域[22]。

过量表达的IAPs 可以使肿瘤细胞对化疗产生耐药性，同时也抑制了化疗或放疗引起的凋亡。线粒体smac/Diablo 蛋白对于凋亡具有抑制作用[3]。在凋亡抑制蛋白家族中研究较多的是Survivin 蛋白。Survivin结构较为独特，含有一个N 末端的杆状凋亡抑制蛋白重复序列，羧基末端无环指结构，而是α-螺旋，其基因定位于染色体17q25，有3 个内含子和4 个外显子，编码142 个氨基酸蛋白，约16.5 kD，Survivin 具有肿瘤特异性。高表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖、浸润及转移密切相关。生存素mRNA阳性患者5年生存率明显低于生存素mRNA 阴性的患者[23]。Li 等[24]研究表明，兔子肝脏种植上VX-2 肿瘤后，经过ATO 干预后，肿瘤组织上的Survivin 的表达水平较对照组明显降低，从而证明Survivin 可能在ATO 诱导细胞凋亡的过程中发挥一定作用。

3.8 ATO 抑制端粒酶活性及端粒酶逆转录基因的表达

有证据表明，ATO 可能通过抑制端粒酶的活性及缩短端粒酶的长度来达到抑制肿瘤生长的目的，这种作用具有浓度和时间依赖性[25]。Zhou 等[26]研究发现，经过ATO 处理后端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA 的表达与端粒酶的活性成比例下降，表明ATO 对端粒酶活性的作用受hTERT 转录基因的调控，另外，逆转录酶和hTERT mRNA 和凋亡程度存在正相关。目前已确定端粒酶活性的抑制是凋亡程序的早期事件[27]。向宫颈癌细胞转染野生型hTERT 后，大大降低了脱乙酰化酶抑制剂诱导的细胞凋亡，因此，ATO 对于端粒酶的抑制可以认为是走向凋亡的重要事件。

3.9 ATO 抑制NF-κB 活性

Rel-NF-κB 蛋白家族由五种单体组成同源二聚体或异源二聚体。当细胞未受到刺激时，NF-κB 通过与其特异性抑制剂IκB 相互作用，以一种非活性状态存在于细胞质中。一旦经过多重信号通路激活，IκBs将发生磷酸化并迅速降解，游离的NF-κB 二聚体跨过核膜进入细胞核内，结合到κB 结合位点的引物区域，诱导靶基因的转录。ATO 对于NF-κB 的作用目前存在争议。Amrán 等[28]在幼稚单核细胞白血病细胞系中发现ATO 并不能增加NF-κB 的转录活性，并得出结论：ATO 诱导的单核细胞白血病细胞系的凋亡不依赖于NF-κB 的结合活性，而与死亡受体途径及线粒体途径相关。Xu 等[29]研究表明，在MUTZ-1 和SKM-1细胞系中，ATO 诱导凋亡通过两种独立的途径：①激活Caspase 3、8 及DNA 聚合酶；②抑制NF-κB 的活性，继而下调端粒酶转录酶的表达。Ma 等[30]对肝癌细胞系进行研究表明，ATO 抑制了NF-κB 的活性，继而调节了cyclin D1、Bcl-xL、Bcl-2 等凋亡相关基因的表达，最终导致了细胞的凋亡。

综上所述，ATO 诱导的肿瘤细胞凋亡为非单一机制，从刺激活性氧的产生、抑制p53、调节Bcl-2 家族、升高细胞内钙离子浓度、降低线粒体跨膜电位到激活Caspase 家族，以及对凋亡抑制蛋白、NF-κB 的调控，参与到线粒体途径诱发细胞凋亡的各个环节中，对其机制的研究，为选择ATO 增敏剂提供了更广泛的思路，可为ATO 耐药患者的临床治疗寻找更多的方法。如现在人们已经发现维生素C 或L-丁硫氨酸-SR-磺基（BSO）可以降低细胞内还原型谷胱甘肽浓度，其为活性氧主要消除物质，这样间接地增加了细胞内活性氧浓度，使得肿瘤细胞对于ATO 更加敏感[31]。

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