高脂膳食与运动对小鼠脑内cAMP反应元件结合蛋白基因表达的影响

云少君 乔 欣 李 蔓 魏守刚

(山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太原 030801)

cAMP反应元件结合蛋白(CREB)能够调节神经元生成、突触可塑性及学习记忆等方面〔1〕，其异常表达及活性变化参与了某些神经退行性疾病的病理生理过程〔2〕。近年来许多研究显示〔3〕脑老化性学习记忆功能障碍的原因之一是衰老过程中脑神经元大量凋亡。生活方式能影响神经功能，特别是富含脂类的饮食结构能够导致老化过程中的认知障碍〔4〕，加速阿尔茨海默病(AD)的痴呆过程〔5〕，而运动是抗衰老保护脑健康的有效措施之一。本研究拟观察脑老化情况下CREB基因的表达情况，同时进行高脂膳食和运动干预，探讨不同生活方式对脑老化的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理 70只雄性美国癌症研究所(ICR)小鼠按体重随机分为普通对照组、高脂对照组、运动对照组、普通脑老化组、脑老化+高脂组、脑老化+运动组及脑老化+高脂+运动组。脑老化小鼠模型的建立参见文献〔6〕，本实验皮下注射D-半乳糖的剂量调整为50 mg/kg(1次/d，连续10 w)，对照组小鼠注射等量生理盐水。按文献〔7〕特制高脂鼠料:79%基础饲料、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇(军事医学科学院动物科学部加工)。小鼠运动训练方案参照文献〔8，9〕进行，经预实验调整后确定为:小鼠在电动跑台上每周训练6 d，每天跑步500 m，其中第1周以10 m/min的速度运动，以后每周跑步速度递增5 m/min，至第4周增至25 m/min后维持该速度运动直至实验结束，实验期共10 w。

1.2 Morris水迷宫试验 参照文献〔10〕进行 Morris水迷宫实验。本实验中调整为:水迷宫试验每天测试1次，共进行7 d，学习期为开始3 d，将小鼠放在站台上熟悉15 s后再下水航行，若2 min内不能自动找到站台，则人工帮助其登陆站台并停留15 s以学习记忆;巩固期为其后2 d，小鼠自由航行2 min寻停站台，人工不再帮助其登陆站台。第6、7天进行正式测试，逃避潜伏期测试数据平均值用于小鼠学习记忆能力的分析，若2 min内不能自动找到站台则记录为逃避潜伏期120 s。

1.3 CREB基因表达测定(RT-PCR法)Morris水迷宫实验结束后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取脑组织(去除小脑)称重，置于液氮速冻后于－70℃冰箱保存待测。以RT-PCR法测定CREB基因的表达水平。具体实验操作见相关试剂盒说明书。引物序列:CREB:5'-TCA GCCGGGTACTACCAT TC-3'及5'-TCT CTT GCT GCT TCC CTG TT-3'。内参照β-actin:5'-GTT ACCAAC TGG GAC GAC A-3'及5'-GGA ACC GCT CGT TGC CAA-3'。PCR 扩增条件:CREB:94℃ 3 min，94℃ 30 s→55℃30 s→72℃ 1 min，30 个循环后，72℃ 10 min。β-actin:94℃3 min，94℃ 45 s→60℃ 60 s→72℃ 60 s，35 个循环后，72℃5 min。采用凝胶成像分析系统对扩增产物的电泳分离条带进行灰度值测定，计算目的基因扩增产物与内参基因扩增产物灰度值的比值表示目的基因表达的相对量。

1.4 统计学分析 用SPSS17.0进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 小鼠学习记忆能力测评 Morris水迷宫行为学实验结果表明脑老化小鼠模型建模成功。普通脑老化组〔(59.33±25.54)s〕与脑老化+高脂组〔(56.42±10.20)〕s小鼠的逃避潜伏期均大于普通对照组〔(32.58±8.99)〕s(P＜0.05)。脑老化+运动组小鼠的逃避潜伏期〔(24.75±8.72)〕s低于普通脑老化组(P＜0.05)，与普通对照组相比差异显著。脑老化+高脂+运动组小鼠的逃避潜伏期〔(53.67±14.94)s〕大于普通对照组(P＜0.05)，与普通脑老化组相比无统计学差异。高脂对照组小鼠的逃避潜伏期〔(58.10±4.74)〕s大于普通对照组(P＜0.05)，运动对照组〔(31.17±8.98)s〕与普通对照组比较差异无统计学意义。

2.2 CREB基因表达情况 普通脑老化组小鼠脑CREB基因表达水平(0.68±0.35)低于普通对照组(3.24±0.80)(P＜0.05)。脑老化+高脂组小鼠脑CREB基因表达水平(0.58±0.25)低于普通对照组(P＜0.05)，与普通脑老化组之间无统计学差异。脑老化+运动组小鼠脑CREB基因表达水平(2.01±1.28)高于脑老化组(P＜0.05)，与普通对照组之间差异无统计学意义。脑老化+高脂+运动组(0.99±0.66)与普通对照组相比表达量降低(P＜0.05);与普通脑老化组相比虽有所增高，但无统计学差异。与普通对照组相比，高脂对照组(0.52±0.12)有所降低(P＜0.05);运动对照组CREB基因表达水平(1.73±0.20)差异无统计学意义。

3 讨论

本实验结果表明:(1)D-半乳糖诱导性脑老化小鼠CREB基因表达下降，这种变化与以前关于神经退行性疾病和神经元凋亡关系的报道相似〔11〕。作为细胞存活因子信息转导途径中的最后一个成分，通过其分子中Ser-133的磷酸化，CREB由无活性型转变成活性型，结合到相关基因，引起靶基因的表达〔11，12〕，而发挥抑制凋亡作用。对正常老龄大鼠的研究，也发现有脑神经元大量凋亡现象，因为神经系统接受、处理和储存信息的能力在某种程度上与细胞数量相关，因此这可能是脑老化性学习记忆功能障碍的原因之一。(2)高脂膳食使小鼠的CREB基因表达下降，但是其与D-半乳糖并无明显的协同作用。高脂膳食使血管和血液流变学参数发生负性改变，能够导致血管弹性下降、血液黏滞度增加、血流速度减缓等，造成大脑供血供氧不足，并且长期脂肪酸摄入过多，使脂质过氧化物产生增加。这些变化直接促进脑内自由基形成增多，而脑组织由于相对地缺乏GSH等抗氧化物质，故易发生过氧化反应，进一步导致脑组织氧化损伤，进而引起神经元的过度凋亡。(3)运动可以防止脑老化小鼠的CREB基因表达下调，延缓脑老化。脑老化过程中给予运动干预能够抵制CREB mRNA表达的不断下调，对抗神经元凋亡，从而达到延缓脑老化的作用。本研究还显示，运动对正常小鼠脑内CREB基因表达并无明显上调作用，运动通过影响神经元凋亡而保护脑健康的效应可能更主要的体现在抗脑老化过程中。

因此，本研究提示老年人避免长期高脂膳食及坚持运动锻炼对于预防脑老化、促进脑健康有长远的现实意义。

1 宋海龙，郑 焱，王晓民.CREB信号通路在神经系统中的调控及功能〔J〕．中国生物化学与分子生物学报，2013;29(9):797-804.

2 Leutgeb JK，Frey JU，Behnisch T.Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures〔J〕．Neuroscience，2005;131(3):601-10.

3 Winter E.Effects of an extract of Ginkgo biloba on learning and memory in mice〔J〕．Pharmacol Biochem Behav，1991;38(1):109.

4 Chen KS，Masliah E，Mallory M，et al．Synatic loss in cognitively impaired aged rats is ameliorated by chronic human nerve growth factor infusion〔J〕．Neuroscience，1995;68(1):19-27.

5 Kalmijn S，Foley D，White L，et al．Metabolic cardiovascular syndrome and risk of dementia in Japanese-American elderly men:the Honolulu-A-sia aging study〔J〕．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000;20:2255-60.

6 庞在英，李桂荣，杜怡峰.海风藤提取物对D-半乳糖脑老化模型小鼠行为、海马神经细胞线粒体膜电位及凋亡的影响〔J〕．中国老年学杂志，2007;16(27):1555-57.

7 Koudinov AR，Koudinova NV.Essential role for cholesterol in synaptic plasticity and neuronal degeneration〔J〕．FASEB J，2001;15:1858-60.

8 程志清，龚立波，姚 立.强迫跑步法建立 BALB/C小鼠心气虚证模型〔J〕．浙江中医学院学报，2003;27(6):42-5.

9 杜少武，吴纪饶.复方白蚁制剂对训练大鼠血清睾酮、皮质醇的影响〔J〕．中国运动医学杂志，2005;24(6):714-5.

10 高秋菊，勾凌燕，王 憬，等.不同剂量碘对迷宫前后鼠脑神经递质的影响〔J〕．中国公共卫生，2005;21(6):710-11.

11 Yuan J，Yankner BA.Apoptosis in the nervous system〔J〕．Nature，2000;407(7):802-9.

12 Lambeng N，Michel PP，Brugg B，et al．Mechanisms of apoptosis in PC12 cells irreversibly differentiated with nerve growth factor and cyclic AMP〔J〕．Brain Res，1999;821(1):60-8.