水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响

李红梅，王显

· 论著 ·

水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响

李红梅，王显

目的探讨水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）生长的影响及剂量依赖关系，明确水蛭素抗再狭窄的有效性和可行性。方法用体外培养的HCASMC和HCAEC 3～5代，加入96孔细胞培养板，设置调零孔、对照孔、加药孔（6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/ml不同浓度水蛭素共9组，每组6个复孔），培养48 h后用噻唑蓝比色试验（MTT法）检测不同浓度水蛭素干预下两种细胞的活力和抑制率变化。结果与对照组相比，低浓度（0.025～0.1 mg/ml）水蛭素在对HCASMC增殖的影响方面无统计学差异（P均＞0.05），而中高浓度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖，差异有统计学意义（P均＜0.05），且其抑制率随水蛭素浓度升高而增加。与对照组相比，0.025～3.13 mg/ml的水蛭素在对HCAEC增殖的影响差异无统计学意义（P均＞0.05），但0.05～0.2 mg/ml的水蛭素对HCAEC有一定的促增殖作用；而高浓度（6.25 mg/ml）的水蛭素对HCAEC增殖的抑制增加，差异有统计学意义（P均＜0.05），其抑制率达到44.6%。结论中高浓度水蛭素可呈剂量依赖性抑制HCASMC的生长，低中浓度水蛭素对HCAEC无明显抑制作用，且能在抗血栓的同时保护HCAEC甚至促进HCAEC生长。

水蛭素；人冠状动脉平滑肌细胞；人冠状动脉内皮细胞；抑制率

动脉粥样硬化性心血管疾病引发的急性心血管事件严重危害人类生命健康，经导管支架植入术成为目前治疗的有效途径，其中药物洗脱支架的出现更是推动了介入的发展。随着研究逐步深入，发现药物洗脱支架抑制平滑肌细胞增殖迁移，同时也延缓内皮化进程，支架术后遗留的10%～20%再狭窄以及延迟性支架血栓形成风险成为介入领域广泛关注的热点和难点。近年，水蛭素作为凝血酶的特异性抑制剂，在减轻实验性再狭窄和抗血栓方面有很好的应用前景。本研究利用细胞培养技术，观察不同浓度水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）生长和增殖的影响，以期为药物涂层支架的研发提供实验数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂HCASMC（货号：FC-0031）、HCAEC（货号：FC-0032）、内皮细胞和平滑肌细胞培养基、胰酶、胰酶抑制剂、冻存液均购自美国Lifeline公司；磷酸盐缓冲液、噻唑兰（MTT）粉末250 mg、二甲基亚矾（DMSO）瓶装100 ml均购自北京索莱宝科技有限公司；科研级天然水蛭素冻干粉（武汉胜天宇生物科技有限公司）。

1.2 仪器超净工作台CJT-E-Ⅱ（北京昌平长城空气净化工程公司）、倒置相差显微镜（Olympus CKX×41）、低速离心机LD4-2（北京雷勃尔离心机有限公司）、培养箱MCO-20AIC（SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低温冰箱（美国REVCO Legaci）、电热恒温水箱（HH. W21.420）、全自动酶标仪（Clinicbio 128C）、电子分析天平（日本岛津AEC-45SM）。

1.3 方法

1.3.1 HCASMC和HCAEC将保存于液氮中的细胞取出，立刻放到干冰上，将细胞浸入37℃水浴中，待细胞悬液融化后接种于培养瓶，放入培养箱（37℃，5%CO2）培养，次日更换培养基。之后2～3 d传代一次，实验选用4～6代细胞。

1.3.2 实验分组设置调零组、对照组（5个复孔）、干预组（6个复孔）。调零组不加细胞，对照组仅加细胞，干预组给予不同浓度药物（6.25 mg/ml组、3.13 mg/ml组、1.56 mg/ml组、0.78 mg/ml组、0.39 mg/ml组、0.2 mg/ml组、0.1 mg/ml组、0.05 mg/ml组、0.025 mg/ml组）。

1.3.3 细胞接种当细胞占整个瓶底70%～80%时，将细胞消化计数后调整细胞密度为8×104个/ mL，接种于96孔板（调零组加100μl无细胞培养基），100μl/孔，边缘孔加入150μl PBS液，然后置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日加药。

1.3.4 加药次日取出96孔板以无菌PBS冲洗2遍，调零组和对照组每孔加入100μl正常培养基，干预组每孔加入含相应浓度水蛭素的培养基，置于37℃，5%的CO2培养箱中，孵育48 h。

1.3.5 细胞抑制率检测48 h后向各孔培养基内加入20μl 0.5 mg/ml的对应MTT培养基溶液，然后置于37℃，5% CO2培养箱继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加150μl DMSO振荡10 min，待结晶全部溶解后于酶标仪492 nm处测各孔A值，并计算不同浓度水蛭素对平滑肌细胞及内皮细胞生长的抑制率。细胞抑制率=1-（干预组OD值/对照组OD值）×100%。

1.4 统计学处理计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间均数的比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。

2 结果

2.1 细胞培养通过倒置相差显微镜观察，刚复苏的HCASMC和HCAEC均漂浮于培养基中呈未贴壁状态，细胞缩为圆形，单个或成团存在，体积较小；培养6 h后大部分细胞贴壁，24 h后细胞贴壁完全。贴壁的HCAEC由圆形变为椭圆或多角形，折光性较强，胞质丰富，呈“铺路石”样排列，4 d后进入对数生长期；HCASMC贴壁后逐渐变为梭形，伸展性好，透明度增加，3 d后进入对数生长期并相互重叠生长，呈致密束状排列。

2.2 不同浓度水蛭素对HCASMC生长及增殖的影响倒置显微镜镜下观察，低浓度水蛭素（0.025～0.2 mg/ml）作用48 h后细胞形态及数量未见明显改变，中高浓度水蛭素（0.39～6.25 mg/ ml）作用24 h即可见细胞形态略有改变，48 h后细胞数量减少、排列疏松。统计学结果显示：与对照组相比，低浓度（0.025～0.1 mg/ml）水蛭素在对HCASMC增殖的影响方面无统计学差异（P均＞0.05），细胞抑制率均低于11%，而中高浓度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖，差异有统计学意义（P均＜0.05），且其抑制率随水蛭素浓度升高而增加，最高可至77.85%（表1、图1）。

表1 不同浓度水蛭素抑制HCASMC增殖的比较

图1 不同浓度水蛭素对人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响（*代表与对照组相比，水蛭素对HCASMC有明显抑制作用；#代表与对照组相比，水蛭素对HCAEC有明显抑制作用）

2.3 不同浓度的水蛭素对HCAEC生长及增殖的影响 倒置显微镜镜下观察，低浓度及中高浓度水蛭素（0.025～3.13 mg/ml）作用48 h后细胞形态及数量未见明显改变，呈单层贴壁状态，高浓度水蛭素6.25 mg/ml作用48 h后可见细胞数量减少，贴壁的细胞有部分脱落。

结果显示：与对照组相比，0.025～3.13 mg/ml的水蛭素在对HCAEC增殖的影响差异无统计学意义（P＞0.05），但0.05～0.2 mg/ml的水蛭素对HCAEC有一定促增殖作用；而高浓度（6.25 mg/ml）的水蛭素则对HCAEC增殖产生较明显的抑制作用，抑制率达44.6%，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2、图1）。根据原则需要挑选对HCASMC抑制程度最大，而对HCAEC抑制程度最小的浓度范围，最终选择0.2～3.13 mg/ml浓度组的水蛭素作为下一步实验水蛭素的浓度区间。

3 讨论

表2 不同浓度水蛭素抑制HCAEC增殖的比较

目前认为，介入术后再狭窄的机制可能与以下因素有关：球囊扩张对血管壁的损伤，血管弹性回缩及血管收缩，血小板聚集黏附及血栓形成，炎症反应，血管平滑肌细胞增生迁移及动脉内膜增生、血管重塑等[1]，其中血管平滑肌细胞的增殖迁移和内皮细胞的内皮化延迟是再狭窄的关键环节。近年很多学者对介入术后再狭窄进行了大量研究，通过实验及临床结果证实很多天然单体防治再狭窄具有可靠的临床疗效，如水蛭素、三氧化二砷、大黄素、雷公藤红素、丹参提取物等都有不少报道，在这些有效的天然提取物中，水蛭素除了能抑制平滑肌细胞增殖迁移外，以其独特的抗血栓作用引起了我们的关注。

破血逐瘀的水蛭素是水蛭唾液的提取物之一，为凝血酶的特异性抑制剂，天然水蛭素第63位的酪氨酸被硫酸化，作用于凝血酶4个结合位点中的非活性底物识别位点和酶活性中心而发挥抗凝作用，该作用不依赖于抗凝血酶Ⅲ、肝素辅助因子Ⅱ、蛋白C或组织因子途径抑制物，且不被血小板结合而失活，其抗凝和抗血栓作用比肝素更强。张涛等[2]发现水蛭素可通过抑制家兔介入术后平滑肌细胞增殖、减轻内膜增生而发挥抗再狭窄作用。周小明等[3,4]研究发现，水蛭素可呈剂量依赖性显著抑制兔血管平滑肌细胞增殖和氚脱氧胸腺嘧啶（3H-TDR）的摄取，同时给动脉损伤大鼠予水蛭素粗提取物灌胃后14 d取颈总动脉进行病理学观察，可见水蛭素对损伤侧血管内膜增生有明显的抑制作用。从以上研究结果可以看出，中药水蛭素在防治介入术后再狭窄方面有着很好的研究前景，其对平滑肌细胞的抗增殖作用基本明确，然而目前针对单药水蛭素对血管内皮细胞生长增殖影响的报道尚为数不多。因此，本研究用噻唑蓝（MTT）法以不同浓度水蛭素干预HCASMC和HCAEC，以初步探究水蛭素的抗再狭窄机制并摸索出水蛭素的有效浓度范围。

MTT法[5]是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。因本方法具有灵敏度高、经济实用的特点，故本研究选择MTT法作为检测细胞生长增殖情况的基本方法。

研究发现[6]，3.13～25 μg/mL的水蛭素能在最大限度抑制兔平滑肌细胞的同时，尚能最大化保护内皮细胞，利用前期研究的浓度范围作了一系列预实验后发现，人冠状动脉细胞对药物的耐受性强于兔血管细胞，此浓度范围对人血管细胞未产生影响。经过摸索后选出人冠状动脉细胞反应良好的0.025～6.25 mg/ml作为正式实验浓度范围进行筛选。本研究发现，低浓度（0.025～0.1 mg/ ml）水蛭素对HCASMC生长和增殖没有影响，而中高浓度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素则对HCASMC的增殖有明显抑制作用，且其抑制率与水蛭素浓度呈正相关。在对内皮细胞影响方面，低中浓度（0.025～3.13 mg/ml）水蛭素对HCAEC生长的抑制作用不明显，其中0.05～0.2 mg/ml的水蛭素对HCAEC有一定促增殖作用，而高浓度（6.25 mg/ml）的水蛭素即可显著抑制HCAEC的生长和增殖，其抑制率接近50%。

综上所述，水蛭素不仅有很好的抑制平滑肌细胞作用，还能在抗血栓的同时保护内皮细胞甚至促进其生长。基于此，能否将水蛭素与另外一种具有很好抗平滑肌增殖但保护内皮细胞力量不足的单体联合应用，放大水蛭素优势的同时达到联合增效的目的呢？本团队将在后续的研究中对该假设加以证实，拓宽水蛭素的应用空间。

[1] 黄洁,张梅英,刘利兵. PTCA后冠状动脉再狭窄的研究进展[J]. 第四军医大学学报, 2001,22(2):104-5.

[2] 张涛,杜兰萍,崔平,等. 水蛭和丹参对血管成形术后平滑肌细胞增殖影响的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志,1998,18(3):159-61.

[3] 周小明,陆再英. 水蛭素对培养的兔动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用[J]. 中国循环杂志,1996,11(2):103-5.

[4] 周小明,陆再英,汪道文,等. 水蛭素粗提物对实验性动脉内膜增生的抑制作用[J]. 中药药理与临床,1996,2(2):17-9.

[5] 司徒镇强,吴军正. 细胞培养[M]. 世界图书出版公司,1996:186-8.

[6] 任晓霞. 紫杉醇水蛭素复合物对兔血管内皮细胞和平滑肌细胞生长的影响[D]. 山西:山西医科大学,2011.

Influence of hirudin on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells and human coronary artery endothelial cells

LI Hong-Mei*, WANG Xian.*Institute for Cardiovascular Disease, First Clinical Medicine College, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China.

WANG Xian, E-mail: wx650515@163.com

ObjectiveTo investigate the influence of hirudin on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells (HCASMC) and human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and dose-dependent relation, and indentify the effectiveness and feasibility.MethodsHCASMC and HCAEC cultured in vitro (3-5 generations) were respectively seeded onto 96-well plates, and then co-incubated with different doses of hirudin (6.25 mg/ml, 3.13 mg/ml, 1.56 mg/ml, 0.78 mg/ml, 0.39 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, and 0.025 mg/ml). After 48 h, the changes of viability and inhibitory rate of HCASMC and HCAEC were detected by using MTT.ResultsCompared with control group, the influence of low-dose hirudin (0.025 mg/ml～0.1 mg/ml) on HCASMC proliferation had no statistical difference (all P＞0.05), and that of mid-dose and high-dose of hirudin (0.2 mg/ml～6.25 mg/ml) inhibited HCASMC proliferation (all P＜0.05) and the inhibitory rate increased as the increase of hirudin dose. Compared with control group, the influence of hirudin in dose of 0.025 mg/ml～3.13 mg/ml on HCAEC proliferation had no statistical difference (all P＞0.05), but hirudin in dose of 0.05 mg/ml～0.2 mg/ml had improvement effect on HCAEC proliferation. The inhibition of hirudin in high dose (6.25 mg/ml) on HCAEC proliferation increased (all P＜0.05) and inhibitory rate reached 44.6%.ConclusionHirudin in mid-dose and high-dose can inhibit HCASMC growth in and dosedependent manner, while hirudin in low-dose had no significant inhibitory effect on HCAEC growth, and can protect even improve HCAEC growth at the same time of anti-thrombosis

Hirudin; Human coronary artery smooth muscle cells; Human coronary artery endothelial cells; Inhibitory rate

R543.3

A

1674-4055(2015)06-0792-03

2015-08-07）

（责任编辑：姚雪莉）

100700 北京,北京中医药大学第一临床医学院博士研究生;北京中医药大学心血管病研究所

王显,E-mail:wx650515@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.06.21