白酒发酵与蒸馏过程中5种生物胺变化

范文来,徐 岩,温永柱

(教育部工业生物技术重点实验室,江南大学生物工程学院酿酒微生物与应用酶学研究室,江苏无锡 214122)



白酒发酵与蒸馏过程中5种生物胺变化

范文来,徐 岩*,温永柱

(教育部工业生物技术重点实验室,江南大学生物工程学院酿酒微生物与应用酶学研究室,江苏无锡 214122)

应用液液微萃取(LLME)结合高效液相色谱(HPLC)检测,建立了白酒固态发酵酒醅中多种生物胺的定量分析方法。以某兼香型酒K厂酒醅为试样,对酒醅发酵及蒸馏过程中生物胺的变化进行研究,定量方法包括震荡提取、离心、液液微萃取、丹磺酰氯柱前衍生、RP-HPLC检测。结果表明,腐胺和尸胺随着酒醅发酵时间延长,含量增加,且只有很少量的被蒸馏进入酒中。吡咯烷是白酒的主要生物胺,在蒸馏过程中大部分被蒸馏出来。与其它饮料酒相比,白酒中的生物胺含量是最低的。

白酒,生物胺,发酵,蒸馏,衍生化

生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称[1],可以看作是氨分子中1～3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质,是脂肪族、酯环族或杂环族的低分子量有机碱,广泛存在于发酵食品和饮料酒中[2-4]。

首次研究饮料酒中生物胺是1965年,当时应用色谱对葡萄酒中的慢性有毒物质进行研究,检测到组胺。目前为止,葡萄酒、啤酒、黄酒中生物胺的研究较多[5-7],检测到的生物胺种类达到几十种之多,常见的是单胺类的组胺(histamine,来源于组氨酸)、酪胺(tyramine,来源于酪氨酸)、苯乙胺(2-phenylethylamine,来源于苯丙氨酸)和色胺(tryptamine,来源于色氨酸),二胺类的腐胺(putrescine,来源于鸟氨酸)和尸胺(cadaverine,来源于赖氨酸),聚多胺类的精胺(spermidine)和亚精胺(spermine,这两个胺来源于腐胺)等[8]。最新的研究结果表明,我国啤酒中生物胺总量4.79mg/L,葡萄酒11.24mg/L,黄酒最高可达78.30mg/L[9]。

白酒中生物胺的研究较少。早期,杜木英等人利用氨基酸自动分析液相色谱法对青稞酒发酵过程中的生物胺的动态变化进行过研究[10],但定性的生物胺较少。2013年,范文来等人对白酒中可能含有的生物胺进行了系统的鉴定,共鉴定出9种生物胺,包括甲胺、乙胺、异戊胺、吡咯烷、环己胺、环戊胺、环庚胺、腐胺和尸胺[11]。同年,开发了白酒中生物胺检测方法—丹磺酰氯衍生化结合紫外-反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,并对不同香型白酒中的生物胺进行了定量,发现吡咯烷在白酒中含量最高。浓香型和清香型白酒总生物胺含量较高,而酱香型白酒较低[12]。本文在前期研究的基础上,进一步开发固态基质(酒醅)中生物胺的定量方法,并对酒醅发酵和蒸馏过程中生物胺的变化进行研究,初步探索白酒中生物胺产生的原因,为后续研究白酒生物胺产生机理、开发生物胺的降低措施提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

K酒厂酒醅,由某兼香型白酒厂提供,当天取样后-15℃冷冻,24h内运至实验室,并-15℃冷冻待用。使用时,室温解冻。

乙胺盐酸盐、甲胺盐酸盐、吡咯烷、腐胺盐酸盐、尸胺盐酸盐 购自sigma公司的纯净标准品;丹磺酰氯(Dansyl chloride) 购自美国sigma-Aldrich公司;乙腈(色谱纯) 购于上海安普仪器有限公司;三氯乙酸、丁醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、浓盐酸、氢氧化钠、氯化钠、饱和碳酸氢钠 均为分析纯;实验室专用水:超纯水(Milli-Q系统)使用前煮沸5min。

冷冻离心机 Bekman公司;高效液相色谱[DIONEX SUMMIT]戴安中国有限公司;DC-12型氮吹仪 上海安普科学仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;涡旋仪 上海琪特分析仪器有限公司;pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 酒醅中生物胺定量方法

1.2.1 生物胺提取 参照国家标准的方法[13],取粉碎的酒醅10g加入100mL锥形瓶,三氯乙酸(5%)震荡提取1h,3600r/min离心10min,上清液转入小烧杯,重复提取两次,漏斗过滤,定容到50mL。

1.2.2 分离与衍生 参考Dugo等的方法[14]并进行了优化,5mL提取液,加入1.5g NaCl饱和,加入3mL正丁醇、氯仿(1∶1),用pH为13的Na2CO3和NaOH缓冲溶液调pH至11.5,涡旋仪旋转震荡4min,收集有机相,重复萃取两次。加入1mL 1mol/L HCl混匀,氮气吹干,加入2mL 0.1mol/L HCl溶解,加入2mL丹磺酰氯衍生剂(9mg/mL,溶剂为丙酮),调pH为8.6,震荡混匀后,40℃水浴避光衍生1h。反应结束后,加入3mL乙酸乙酯,重复萃取三次,合并萃取液,氮气吹干,加入1mL乙腈溶解,0.45μm有机滤膜过滤,进样。

1.2.3 液相色谱条件 参考Dugo等的方法并进行优化[14],Agilent C18色谱柱(4.6×250mm,5μm),检测波长为254nm,柱温为20℃,进样量10μL,利用外标法峰面积定量。梯度洗脱,流速为0.4mL/min,流动相A为乙腈,B为超纯水。洗脱程序:0～6min,A为30%;6～12min,A为30%～80%;12～25min,A为80%～85%;25～32min,A为85%～30%。

1.3 白酒中生物胺测定

参照温永柱等人的方法测定[12]。

2 结果与讨论

2.1 固态基质酒醅中生物胺定量方法

固态基质酒醅中生物胺的提取采用国标的方法[13],其测定方法依参考文献的方法[12]优化。在酒醅中添加相似浓度的混合标准品,测定固态基质中生物胺定量方法的相对标准偏差(RSD),并计算回收率。由表1可知,定量方法的精确度和准确度较好,回收率在77%～105%之间,其中甲胺的回收率偏低,推测是甲胺易挥发,在提取、萃取过程中损失比较大。

表1 固态基质中定量方法的回收率和RSD(n=3)Table1 RSD and recovery ofbiological amines detected in solid matrix(n=3)

2.2 酒醅发酵过程中5种生物胺变化

根据建立的固态白酒酒醅中生物胺的定量方法对不同发酵时间的酒醅进行定量检测。选取5个时间点,即发酵0、10、20、30和60d酒醅,图1是5种生物胺在酒醅发酵过程中的变化趋势。

图1 K酒厂酒醅中5种生物胺含量各自随着时间的变化Fig.1 Changes of biogenic amines of fermented grain from K distillery in the fermentation

酒醅发酵过程中生物胺总量先随发酵时间上升,到达20d时生物胺总含量最高,达16mg/kg;20d后,腐胺含量先下降,再升高,尸胺含量继续增加,但由于甲胺、乙胺、吡咯烷含量开始下降,致使生物胺总量也开始下降;到达60d时总含量达11.78mg/kg。

从单个生物胺变化看,酒醅发酵过程中,甲胺、乙胺、吡咯烷一般先上升后下降(图1),在20d时含量达到最高,吡咯烷含量居首,最高含量达到5mg/kg。腐胺是前10d含量变化不大,10～20d含量迅速增加,在20d时达到最大值,高出最初含量的一倍;20～30d会下降,但是依然高出初始值;30～60d,腐胺含量平缓上升。推测酒醅中微生物陆续死亡,腐胺积累。腐胺的这一变化与早先文献报道腐胺随着发酵进行呈下降趋势不一样[10]。尸胺初始值为0,从第10～60d,含量一直处于上升状态。在发酵至60d时,尸胺含量是5种生物胺中最高的,达到3.44mg/kg。

表2 不同馏分酒中生物胺的含量(μg/L)Table2 The concentration of biogenic amines of head,heart,and tail cut(μg/L)

注:*:q.l.,小于检测限。

2.3 酒醅配料、蒸馏前后生物胺的变化

兼香型K厂酒醅在配料前至蒸馏后的整个过程中,5种生物胺的变化趋势基本一致(图2)。配料时,由于加入新料,原来酒醅中的生物胺得到稀释,从而使生物胺含量都得到了大幅度的降低。配料前,酒醅生物胺总量是10.46mg/kg,配料后下降到6.93mg/kg,下降了33.74%。其中尸胺的含量降低最大,但乙胺含量几乎未变。

蒸馏后,酒醅中总生物胺含量下降至5.01mg/kg,蒸馏过程下降了27.71%。单个生物胺下降趋势差异较大,其中吡咯烷和乙胺含量降低最大,而尸胺、腐胺含量降低幅度较小,甲胺下降趋势居中。推测由于腐胺和尸胺沸点较高(分别为158℃和178℃),高于白酒蒸馏时的温度,大部分残留在酒醅中。

图2 K酒酒醅蒸馏前后5种生物胺含量的变化Fig.2 The concentration of biogenic amines before and after distillation of fermented grains from K distillery

2.4 白酒蒸馏过程中5种生物胺含量变化规律

酒头、中段酒、尾酒中,甲胺和乙胺含量都是在中段酒时含量最大(表2),结合蒸馏过程酒醅中甲胺和乙胺含量的变化,说明酒醅中大部分的甲胺和乙胺都随着蒸馏过程到达馏分中,并且主要在前中期蒸馏出来。蒸馏过程中,吡咯烷从酒醅进入馏分的量最大,中段酒中吡咯烷的含量达到750μg/L。在整个蒸馏过程中,尤其是中段酒和尾酒中,吡咯烷的含量一直保持一个很高的含量。对腐胺而言,在尾酒中含量达到最高,可能是因为腐胺沸点较高(158℃)。尸胺在各馏分中均低于检测限。从白酒中段酒与酒头的生物胺含量可知,白酒中生物胺的含量要低于瑞士、德国、法国葡萄酒限量标准(分别为10、2、8mg/L)[15-16]。

3 结论

建立了白酒固态基质中多种生物胺的HPLC定量方法,并对酒醅发酵过程中5种生物胺甲胺、乙胺、吡咯烷、腐胺、尸胺的变化进行了研究。酒醅发酵过程中生物胺总量前20d随发酵时间上升,然后逐渐下降,至发酵60d(出窖时)达11.78mg/kg。除尸胺是随着发酵时间一直上升外,其它4个生物胺在发酵前20d上升,然后缓慢下降。

酒醅配料降低生物胺效果好于酒醅蒸馏,二者共同作用,生物胺总量下降61.45%。

蒸馏过程中,低沸点的生物胺进入酒中,且以酒头中为主;高沸点的生物胺如腐胺和尸胺大部分存在于中段酒和尾酒中。这一研究结果将对在酒醅发酵和蒸馏过程中进行生物胺的控制起到指导作用。

[1]Beneduce L,Romano A,Capozzi V,et al. Biogenic amine in wines[J]. Annals of Microbiology,2010,60(4):573-578.

[2]Almeida C,Fernandes J O,Cunha S C. A novel dispersive liquid-liquid microextraction(DLLME)gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)method for the determination of eighteen biogenic amines in beer[J]. Food Control,2012,25(1):380-388.

[3]Cunha S C,Faria M A,Fernandes J O. Gas chromatography-mass spectrometry assessment of amines in port wine and grape juice after fast chloroformate extraction/derivatization[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(16):8742-8753.

[4]Schirone M,Rosannatofalo,Pierinavisciano,et al. Biogenic amines in Italian Pecorino cheese[J]. Frontiers in Microbiology,2012,3(3):1-9.

[5]Lapa-Guimarães J,Pickova J. New solvent systems for thin-layer chromatographic determination of nine biogenic amines in fish and squid[J]. Journal of Chromatography A,2004,1045(1-2):223-232.

[6]Jurado-Sánchez B,Ballesteros E,Gallrgo M. Gas chromatographic determination of N-nitrosamines in beverages following automatic solid-phase extraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(24):9758-9763.

[7]Ali Awan M,Fleet I,Paul Thomas C L. Determination of biogenic diamines with a vaporisation derivatisation approach using solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2008,111(2):462-468.

[8]nal A. A review:Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods[J]. Food Chemistry,2007,103(4):1475-1486.

[9]张敬,赵树欣,薛洁,等. 发酵型饮料酒中生物胺含量的调查与分析[J]. 食品与发酵工业,2012,38(6):165-170.

[10]杜木英,陈宗道,阚建全,等. 青稞酒发酵过程中生物胺动态变化[J]. 食品科学,2012,33(3):163-167.

[11]温永柱,范文来,徐岩. GC-MS法定性白酒中的多种生物胺[J]. 酿酒,2013,40(1):38-41.

[12]温永柱,范文来,徐岩,等. 白酒中5种生物胺的HPLC定量分析[J]. 食品工业科技,2013,34(7):305-308.

[13].食品中生物胺含量的测定. GB/T 5009.208-2008. 中华人民共和国国家标准.

[14]Dugo G M,Vilasi F,Torre G L L,et al. Reverse phase HPLC/DAD determination of biogenic amines as dansyl derivatives in experimental red wines[J]. Food Chemistry,2006,95(4):672-676.

[15]Veciana-Nogues M T,Hemandez-Jover T M-F a E A. Liquid chromatographic method for determination of biogenic amines in fish and fish products[J]. J AOAC Int,1995:78(74)1045-1050.

[16]Martín-lvarez P J,Marcobal,Polo C,et al. Influence of technological practices on biogenic amine contents in red wines[J]. European Food Research and Technology,2005,222(3-4):420-424.

Quantification for 5 selected biogenic amines in fermentation and distillation of Chinese liquor by HPLC

FAN Wen-lai,XU Yan*,WEN Yong-zhu

(Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A liquid-liquid microextraction(LLME)and reverse-phase high performance liquid chromatogramphy(HPLC)method was developed for the quantification for 5 selected biogenic amines in fermented grain and Chinese raw liquor. Quantification method generally includes:oscillation extraction,centrifugation,liquid-liquid microextraction,precolumn derivatization with Dansyl chloride,and RP-HPLC detection. The results showed that the content of putrescine and cadaverine was increased with fermentation time prolong of fermented grains,but few of them could be distilled into raw liquor. Pyrrolidine was the major biogenic amines in Chinese liquors and most could be distilled into raw liquor. Methylamine and ethylamine were detemined in fermented grains,but low concentration of them could exist in raw liquor because of their high volatility. Compared with other alcoholic beverages,Chinese liquor has the lowest content of biogenic amines.

Chinese liquor;biogenic amines;fermentation process;distillation process;derivativation

2014-06-27

范文来(1966-),男,硕士,研究员,研究方向：酿酒工程与食品安全。

*通讯作者:徐岩(1962-)，男，博士，教授，研究方向：微生物酿酒科学与酶技术。

国家863计划项目(2013AA102108)；“十二五”国家科技支撑计划(2012BAK17B11)。

TS201.6

A

:1002-0306(2015)09-0144-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.023