IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型的建立*



IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型的建立*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0956.015.html

江涛， 高婧， 岳欢， 高雅倩， 黄俊琼**

(遵义医学院附属医院， 贵州 遵义563000)

[摘要]目的： 建立IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型，为IL-31RA基因相关研究提供动物模型。方法： IL-31RA基因敲除小鼠严格按照SPF级要求的动物饲养标准进行饲养繁殖，采用聚合酶链式反应(PCR)法鉴定子代小鼠的基因型，RT-PCR法鉴定小鼠IL-31RA mRNA的表达，Western blot鉴定IL-31RA蛋白的表达,HE染色观察小鼠重要脏器的形态学变化。结果： PCR法成功检测出子代小鼠的3种基因型，纯合子基因敲除小鼠未检测出IL-31RA mRNA和IL-31RA蛋白的表达，IL-31RA基因敲除小鼠的重要脏器的形态学特征与野生型小鼠比较无明显变化；基因敲除小鼠可成功饲养繁殖，亦可获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结论： 成功构建了IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型。

[关键词]白细胞介素31； 基因敲除； 聚合酶链反应(PCR)； 反转录PCR； Western blot； 模型，动物

白细胞介素31(Interleukin 31,IL-31)是2004年Dillon等发现的细胞因子，属于白细胞介素6细胞因子家族成员，主要由活化的CD4+Th2细胞产生。IL-31受体(IL-31R)是由IL-31RA与制瘤素M受体B(oncostatin M receptor B, OSMRB)组成的异源二聚体，在皮肤及支气管上皮组织中表达水平较高。国内外研究发现IL-31及其受体与皮肤损伤、秃发症、搔痒、特应性皮炎、气道超敏反应及炎症性肠病等疾病相关，本课题组前期研究发现IL-31及其受体在过敏性哮喘小鼠肺组织中表达增高，IL-31可诱导肺组织分泌趋化因子。为进一步研究IL-31在过敏性哮喘中的作用，本研究成功构建并鉴定出IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型，报告如下。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物IL-31RA基因敲除小鼠品系为C57BL/6J,4周龄，6雄2雌，购自突变小鼠区域资源中心(MMRRC)，在遵义医学院医学与生物学研究中心繁殖扩群。

1.1.2主要试剂Premix Taq(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)(TaKaRa公司)，DL 500 Marker，GoldView，动物组织基因组DNA提取试剂盒(上海生工)，总RNA提取试剂盒(天根生物)，引物由上海生工合成,DEPC(Sigma公司),兔抗鼠IL-31RA抗体、HRP标记羊抗兔IgG抗体(北京博奥森公司) , 化学发光试剂及硝酸纤维素膜(GE公司)。

1.2　方法

1.2.1基因敲除小鼠杂合子模型由MMRRC进行设计及完成。基因敲除过程简述如下：IL-31RA基因组克隆来源于129SvEvBrd基因组文库，构建一个替换型载体替换IL-31RA的第4外显子，即IL-31RA基因组序列(MGI:2180511)中8093-8172碱基，共80 bp；采用电穿孔法将此打靶载体转入C57BL/6J小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，经G418 筛选得到阳性克隆的ES细胞，并将此ES细胞植入假孕的C57BL/6J小鼠子宫内，发育得到杂合子的IL-31RA基因敲除小鼠。所有小鼠均饲养在遵义医学院医学与生物学研究中心的屏障系统(SPF)小鼠饲养室，饲料购自重庆第三军医大学生产的SPF级小鼠饲料【生产许可证号SCXK(渝)2012-0004】，饮用水为消毒纯净水，小鼠所接触物品均高压预真空灭菌。小鼠的性成熟期约35 d，妊娠期约20 d，采用雄雌鼠各1只合笼繁殖。

1.2.2基因敲除小鼠的鉴定因引进的IL-31RA基因敲除小鼠均为杂合子，繁殖出的子代可出现野生型(Wild-type，WT)IL-31RA+/+、杂合子IL-31RA+/-及突变型(Knockout，KO)IL-31RA-/-3种表型，对子代IL-31RA基因敲除小鼠作为模型需先鉴定其基因型。IL-31RA基因敲除小鼠基因组DNA的提取：剪取小鼠尾巴末端约0.6 cm，按说明书操作抽提DNA，双蒸水溶解， 4 ℃保存。聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳鉴定IL-31RA基因敲除小鼠子代基因型：按照参考文献设计引物，WT上游系列为5′-GGGTGTGAACGCTGGAATAATG-3′、KO上游系列为5′-GCAGCGCATCGCCTTCTATC-3′(含有插入的neo基因序列，可鉴定插入的载体片段)、共用下游引物系列为5′-GATCATCTCTCCAAATTTACATG-3′。WT型目的片段长274 bp，KO型目的片段长348 bp。反应体系(25 μL):Premix Taq 12.5 μL, WT和KO上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加灭菌蒸馏水补足体积。循环条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、60 ℃退火 30 s， 30个循环，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存备用。PCR 反应终产物5 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定IL-31RA基因敲除小鼠子代基因型，判断标准为WT型和KO型分别在274 bp与348 bp处出现单一的目的条带，杂合子则在274 bp和348 bp处同时出现目的条带。

1.2.3IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA mRNA的鉴定采用RT-PCR法，IL-31RA基因敲除小鼠总RNA的提取及cDNA的合成：取已经鉴定的WT及KO小鼠肺组织，按照总RNA提取试剂盒操作说明书抽提RNA，逆转录合成cDNA。逆转录体系(20 μL)：5×Prime ScriptTMBuffer 4 μL，Prime Script TM RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Primer(50 μM) 1 μL， Random 6 mers(100 μM) 1 μL，Total RNA 10 μL，RNase Free dH2O补足体积。逆转录反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s； cDNA放于-20 ℃保存。PCR反应及琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA，设计及合成含有IL-31RA基因第4号外显子的基因序列引物，上游系列为5′-TCATTTCTCAGCGTCAGTGG-3′、下游系列为5′-TCCTTCTCTGGTCTCCAAGTG-3′；扩增的目的基因片段长为389 bp。 反应体系(25 μL):Premix Taq 12.5 μL,上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，灭菌蒸馏水补足体积。反应条件： 94 ℃预变性2 min； 94 ℃变性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s， 30个循环；最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存备用。取PCR反应终产物5 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠IL-31RA mRNA。

1.2.4IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA蛋白的鉴定采用Western Blot法，提取已经鉴定的KO及WT小鼠肺组织蛋白质,蛋白定量后以4∶1比例与Buffer混合，100 ℃水浴6 min，常规行SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜,用封闭液 (含50 g/L脱脂奶粉的TBST)室温振摇封闭2 h。依次加入兔抗鼠IL-31RA抗体及 HRP标记羊抗兔IgG,化学发光法曝光显色, 观察结果。

1.2.5IL-31RA基因敲除对小鼠重要脏器的影响脏器系数测定:颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠体重及脏器(心脏、肝脏、肾脏、肺、胸腺及脾脏)的重量，脏器系数=100×脏器重量(g)/体重(g)。HE染色：心脏、肝脏、肾脏、肺、胸腺及脾脏于4%多聚甲醛中固定48 h后，常规石蜡切片，HE染色。在显微镜下观察各个脏器的形态学变化。

1.3　统计学处理

2结果

2.1　IL-31RA基因敲除小鼠的生长繁殖情况

IL-31RA基因敲除小鼠(IL-31RA-/-)能成功繁殖(已繁殖5代)，子代小鼠生长状况良好(已观察1年零6个月)。小鼠约35 d性成熟，性周期为4～5 d，妊娠期约20 d，哺乳期约20 d，每胎产仔数为7～12只，成活率>98%。

2．2　IL-31RA基因敲除小鼠基因型鉴定

小鼠基因型的鉴定结果如图1，其中1、2号小鼠为野生型(IL-31RA+/+)，仅出现274 bp条带；3号小鼠为杂合子(IL-31RA+/-)，同时出现274 bp 和348 bp 2个条带，4、5号小鼠为突变型(IL-31RA-/-)，仅出现1个348 bp条带。

图1　IL-31RA基因敲除小鼠基因型鉴定Fig.1　Identification results of genotype of IL-31RA gene knockout mice

2.3　IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA mRNA的鉴定

RT-PCR结果示WT小鼠(1、2号)检测出389 bp处的条带，而KO小鼠(3、4、5号)未检测出。见图2。

图2　小鼠IL-31RA mRNA的RT-PCR鉴定Fig.2　Identification results of IL-31RA mRNA of the mice

2.4　IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA蛋白鉴定

Western Blot结果示IL-31RA基因敲除小鼠IL-31RA蛋白的相对分子质量为83 kDa，WT小鼠检测到相对分子量约为83 kDa片段，KO小鼠未检出。见图3。

图3　小鼠IL-31RA蛋白的Western Blot鉴定Fig.3　Identification results of IL-31RA protein of the mice

2.5　L-31RA基因敲除小鼠重要脏器系数及HE染色

纯合子IL-31RA基因敲除小鼠与野生型间各脏器的脏器系数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1；两者间形态学也无明显改变，见图4。

表1　L-31RA基因敲除小鼠心脏、肝脏、肾脏、

图4　小鼠各脏器的HE染色结果(×200)Fig.4　HE staining results of each organ of mice

3讨论

IL-31的功能包括调节细胞增殖分化，调节造血和免疫反应，诱导炎性细胞因子和趋化因子分泌，参与调节炎症反应，是重要的炎症因子。IL-31可诱导皮肤炎症，刺激表皮角质细胞分泌趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白3β、胸腺活化调节的趋化因子、T细胞活化蛋白-3[4-6]。Lei Z 等发现过敏性哮喘患者血清IL-31和外周血单核细胞IL-31mRNA均明显高于正常对照组，Shah SA等研究发现IL-31可上调气道上皮细胞黏液素基因MUC5AC的表达；IP WK等采用IL-31在体外刺激人支气管上皮细胞，通过荧光定量PCR检测发现单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)表达增高；Stott B 等[10]发现IL-31可由IL-4诱导表达，可以促进Th2型炎症反应，诱导促炎基因的表达。Liu W等[11]研究发现儿童过敏性鼻炎(AR)伴有哮喘患者血清和鼻灌洗液中IL-31mRNA和IL-31比正常对照组及单纯患AR组显著增高，并且增高趋势与Th2细胞因子及黏蛋白5AC(MUC5AC)的表达一致。近年，越来越多的国内外研究证实IL-31在气道过敏性疾病中发挥重要作用，有望成为该疾病的诊断和(或)监测指标。

IL-31在过敏性哮喘中发挥重要作用，但其具体机制尚不清楚。基因敲除小鼠技术是建立在同源重组理论基础上的一种技术，借助细胞生物学、分子生物学、和动物胚胎学的方法，使小鼠体内某种基因的功能缺失，是阐明该基因功能最直接的手段之一，因此基因敲除技术成为后基因组时代最重要的研究方法和内容[12]。本研究采用同源重组的方法敲除小鼠IL-31RA基因包含在编码信号肽的基因序列内外显子4，使IL-31RA失去功能，通过观察IL-31RA基因敲除小鼠生长繁殖情况，发现IL-31RA基因敲除小鼠与野生型小鼠具有一样的生长繁殖能力，并且IL-31RA基因敲除对小鼠的重要脏器没有明显影响。杂合子小鼠交配后子代可能出现WT、KO及杂合子3种基因型，故必须对它们进行基因型鉴定。本研究采用PCR法对4周龄基因敲除小鼠进行基因型筛选，进一步采用RT-PCR法及Western Blot法对筛选出的WT、KO小鼠进行IL-31RA mRNA及IL-31RA蛋白的表达进行鉴定，结果证明成功构建了IL-31RA基因敲除小鼠的纯合子模型，该模型的成功构建，为更好的探讨IL-31-IL-31R信号在过敏性哮喘中的作用提供了一个很好的动物模型。

参考文献4

[1]Stacey RD, Cindy S, Angela H, et al. Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol, 2004(7):752-760.

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[7]Lei Z, Liu G, Huang Q, et al. SCF and IL-31 rather than IL-17 and BAFF are potential indicators in patients with allergic asthma. Allergy, 2008(63):327-332.

[8]Shah SA, Ishinaga H, Hou B, et al. Effects of interleukin-31 on MUC5AC gene expression in nasal allergic inflammation. Pharmacology, 2013(3-4):158-164.

[9]Ip WK, Wong CK, Li ML, et al. Interleukin-31 induces cytokine and chemokine production from human bronchial epithelial cells through activation of mitogen-activated protein kinase signalling pathways: implications for the allergic response. Immunology, 2007(122):532-541.

[10]Stott B, Lavender P, Lehmann S, et al. Human IL-31 is induced by IL-4 and promotes TH2-driven inflammation. Allergy Clin Immunol, 2013(2):446-454.

[11]Liu W, Luo R, Chen Y, et al. Interleukin-31 promotes helper T cell type-2 inflammation in children with allergic rhinitis. Pediatr Res, 2014(6):1038-1051.

[12]Guan C, Ye C, Yang X, et al. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis, 2010(48):73-85.

(2015-01-08收稿，2015-02-27修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

·基础研究·

Establishment of IL-31RA Gene Knockout Homozygous Mice Model

JIANG Tao, GAO Jing, YUE Huan, GAO Yaqian, HUANG Junqiong

(TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To establish the IL-31RA gene knockout homozygous mice model and lay the foundation for further study on IL-31 gene. Methods: IL-31RA gene knockout mice were bred and reproduced according to the SPF class animal feeding standard. PCR was used to identify the genotype of the offspring, the expression of IL-31RA mRNA was detected by RT-PCR, expression of IL-31RA protein was detected by Western blot, and morphological changes of vital organs were observed by HE staining. Result: Three genotypes of the offspring of IL-31RA gene knockout mice were successfully identified; expression of IL-31RA mRNA and IL-31RA protein was not detected in IL-31RA gene knockout homozygous mice. Compared with the wild type mice, morphological characteristics of vital organs of had no significant changes in IL-31RA gene knockout homozygous mice. IL-31RA gene knockout mice could be dred and reproduced successfully. Conclusion: The IL-31RA gene knockout homozygous mice model has been successfully established.

[Key words]interleukin 31; gene knockout; polymerase chain reaction; reverse transcription-PCR; Western blot; model, animal

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0229-05

通信作者**E-mail:junqiongh@aliyun.com

[基金项目]*国家自然科学基金资助项目(No:81260266)； 贵州省优秀科技教育人才省长专项 (No：黔省专合字200951)