脑脊液流式细胞术检测非霍奇金淋巴瘤中枢神经系统受累的价值*



脑脊液流式细胞术检测非霍奇金淋巴瘤中枢神经系统受累的价值*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1017.025.html

陈梦翔， 黄韵红**， 胡云飞， 申苗苗， 黄德佩

(贵州省肿瘤医院 肿瘤科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 评价脑脊液流式细胞术(CSF-FCM)在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中枢神经系统(CNS)受侵的诊断和预后的价值。方法： 18例NHL初治患者，脑脊液(CSF)采用CSF-FCM和脑脊液细胞学(CSF-C)方法检测，比较两种方法检测中枢神经系统(CNS)受累的阳性率，同时观察患者性别、年龄、临床分期、B症状、乳酸脱氢酶(LDH)、国际预后指数(IPI)评分、体能状态PS评分等相关临床因素的关系。结果： CSF-FCM检测NHL患者CNS受侵的诊断阳性率高于CSF-C，差异有统计学意义(P=0.045)；单因素分析结果显示CSF-FCM在检测NHLCNS受累时免疫表型阳性与年龄、B症状及LDH有关(P=0.039、0.001及0.009)。结论： NHL累及CNS时CSF-FCM免疫表型检测优于传统细胞学检查。

[关键词]非霍奇金淋巴瘤； 中枢神经系统； 脑脊液； 流式细胞学； 细胞学

侵犯中枢神经系统(central nervous system，CNS)的非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin,s lymphoma，NHL)是一种严重危及患者生命的肿瘤，治疗效果不佳，预后差，病死率高。在临床上检测NHL是否侵犯CNS，对NHL的治疗和预后显得尤为重要。目前诊断NHL患者CNS受累的方法主要包括脑脊液细胞学检查(cerebrospinal fluid cytology，CSF-C)和脑脊液流式细胞术(cerebrospinal fluid flow cytometry，CSF-FCM)，其中FCM已被较为广泛的应用到淋巴造血系统疾病的诊断和研究中[1-3]。本研究旨在比较CSF-FCM与传统CSF-C两种检查方法在检测NHL患者CNS受累情况中的优越性及关系，为临床检测NHL中枢神经系统受累情况提供依据。

1材料与方法

1.1　对象

收集淋巴瘤科2012年3月~2013年3月NHL患者18例，男性13例，女性5例，年龄7~74岁，中位年龄49岁。入组病例均经淋巴结或结外组织病理确诊为NHL，既往无鞘内注射化疗史，参照2012年NCCN指南，同时至少具备以下条件之一：(1)病理类型为淋巴母细胞淋巴瘤(lymphoblalstic lymphoma，LBL)、Burkitt淋巴瘤(burkitt lymphoma，BL)等高度侵袭性淋巴瘤；(2)病变累及鼻窦、睾丸、乳腺、硬膜外、大细胞淋巴瘤侵犯骨髓或本身为艾滋病(human immunodeficiency Virus，HIV)合并NHL；(3)有≥2个结外部位受累和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase ，LDH)升高，结外器官受累≥2个是重要危险因素；(4)儿童NHL，主要包括LBL、BL、间变大细胞淋巴瘤以及弥漫大B细胞淋巴瘤；(5)排除其他原因所致的神经学缺陷以及精神状态改变。

1.2　方法

记录患者的性别、年龄、临床分期、功能状态(performance status，PS)评分、B症状、LDH水平、国际预后指数(international prognostic index，IPI)评分等临床资料，应用CSF-C和CSF-FCM检测患者CSF标本的细胞免疫表型，比较两种方法检测NHL合并枢受累诊断的阳性率，分析两种方法与患者年龄、临床分期、B症状及血清LDH等相关临床因素的关系。

所有入组患者均进行腰穿收集CSF，每位患者的CSF分为2份，每份2~3 mL，分别用于CSF-C及CSF-FCM检查。(1)CSF-C新鲜CSF标本，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。采用CSF沉淀室法制片，置于4 ℃冰箱中过夜，自然干燥。CSF-C染色采用迈-格-姬(May-Grunwald-Giemsa，MGG) 染色法，光镜下观察。(2)CSF-FCM制备单细胞悬液，进行表面标志染色。取3支试管，每管中分别加入20 μL以下抗体或同型对照(管1：CD45、CD20、CD22、CD10、CD5、CD19；管2：CD45、CD2、CD3、CD4、CD38、CD8、CD15、CD13、CD117、CD33、CD14；管3：CD45、CD16、CD64、CD11b、CD34、HLA-DR、CD45、Kappa、Lambda、CD19、CD45、FCM7、CD13、CD23；抗体及同型对照均来自于美国Becton-Dickinson公司)。新鲜CSF标本低速离心，1 000 r/min 5 min，弃上清。在显微镜下行CSF细胞计数，调整细胞浓度≤1×106/mL，取80 μL离心后CSF标本，分别加入3支流式管中，流式管中均需加入荧光试剂(PerCP-CY5.5、FITC、PE、APC、PE-CY7、APC-CY7)。混匀后室温避光孵育15 min，再加入1 mL PBS混匀,低速1 000 r/min 5 min离心，弃上清，洗涤2次。分别再加入200 μL PBS上机检测，使用Becton-Dickinson公司FACSDiva Version 6.1.2软件进行分析。(3)阳性标准CSF-C检测是对CSF细胞的形态学研究，CSF中发现瘤细胞是诊断的唯一可靠依据。CSF-FCM免疫表型阳性需结合WHO(2008)血液淋巴瘤分类4th Edition进行分类，并参照白血病脑脊液FCM结果分析。FCM阳性：CSF不混血，FCM可检测到异常免疫表型；CSF混血或血性CSF，FCM异常免疫表型比例高于外周血幼稚细胞比例。

1.3　统计学方法

用四格表资料的χ2检验比较两种方法的优越性；CSF-FCM检测阳性与临床相关风险因素的关系用Logistic回归分析；两种检查方法一致性用kappa检验；P<0.05为差异有统计学意义。经SPSS 19.0统计软件包分析。

2结果

2.1　CNS受累情况

CSF-C与CSF-FCM检测NHL患者CNS受累患者的病例数分别为0例和5例，诊断阳性率分别为0和27.8%。CSF-FCM诊断NHL患者CNS受累的阳性率高于CSF-C，差异有统计学意义(P=0.045)。NHL患者年龄<60岁、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、有B症状及LDH升高时，CSF-FCM优于CSF-CC，P值分别为0.042、0.041、0.021、0.029，见表1。

表1　两种方法与总病例临床因素检测结果(n)

2.2　NHL患者CSF-FCM结果

CSF-FCM检测阳性率与年龄有关，平均(24±16)岁(t=-2.255，P=0.039)，并与有B症状(χ2=10.879，P=0.001)及LDH升高(χ2=6.923，P=0.009)有关，见表2。本组病例经CSF-C细胞学检查未见阳性样本，暂不能推断FCM及细胞学两种检查方法在诊断NHL侵犯CNS时一致性的吻合度。CSF-FCM检测阳性的5例患者，结合临床表现及辅助检查，明确NHL侵犯CNS的有2例，1例为48岁女性(左乳腺弥漫大B细胞淋巴瘤)，见图1-A；1例为7岁男孩(淋巴母细胞淋巴瘤)，见图1-B；2例患者于诊断CNS受累后2~3月内死亡。

表2　FCM与临床因素回归分析

3讨论

CNS侵犯是非霍奇金淋巴瘤的严重并发症，易导致患者死亡[7-10]。研究统计淋巴瘤发生CNS受累患者中数生存期为2.4~4.4个月[9-11]。有CNS侵犯的NHL患者，为避免延误治疗或治疗过度，临床上急切需要寻找NHL侵犯CNS的确切诊断依据。

细胞形态学检查易受主观因素影响，CSF-C检查需要一定的细胞数量，若细胞浓度太低，则很难获得准确的结果[12]。本组18份CSF标本中，经CSF-C检查未发现阳性样本，而CSF-FCM检查发现5例阳性病例，可以认为是CSF-C检查的局限性，造成漏诊。但由于样本较少，还不能对CSF-FCM及CSF-C两种检查方法诊断NHL侵犯CNS进行评价。

图1　NHL患者CSF-FCM阳性脑脊液检测Fig.1　CSF-FCM results of two NHL patients

当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有决定性作用。Hegde U等[13]应用轻链与B和T细胞多种抗体系列的多色FCM来检测其相应抗原的新生物细胞，在CSF总淋巴细胞数仅占0.2%时仍可检出。FCM极为敏感，能检出异常的单克隆B细胞，而单克隆B细胞仅占淋巴细胞总数的0.01%。本组18份CSF标本中，脑脊液FCM阳性率为27.8%，而最终结合临床特征发现确切的CNS受侵的样本数为2例，而这两例患者经CSF-C检查均未见异常，CSF-FCM证实为CNS侵犯的患者分别于诊断CNS受累后2~3月死亡，与文献报道一致[9-11]。本组CSF-FCM诊断阳性率高于CSF-C检查，可见CSF-FCM在检测NHLCNS侵犯时诊断阳性率比细胞学高，更容易发现CSF的病变，能对细胞学假阴性结果所致的遗漏给予补充。

本组病例中有1例确诊B细胞来源的淋巴母细胞淋巴瘤患儿，经CSF-FCM检查证实CNS受侵，原幼细胞占获取细胞的87.2%，主要表达CD2、CD5、CD3、CD4、CD8、CD38，提示为T细胞来源的淋巴母细胞淋巴瘤。因此，CSF-FCM检查能提示NHL中枢受侵时B或T细胞来源，为临床治疗提供正确的指导。

结果显示在检测NHL侵犯CNS时，CSF-FCM检查免疫表型优于传统细胞学，与年龄<60岁、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、有B症状及LDH升高有关。因此在临床工作中，对高度怀疑CNS侵犯，而CSF-C未发现确切证据的NHL病例，建议行CSF-FCM检查，可能更容易获取诊断依据。

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(2014-12-13收稿，2015-01-25修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 周凌

The Values of CSF Flow Cytometry in Detecting CNS Involvement

in the Non-Hodgkin's Lymphomas

CHEN Mengxiang, HUANG Yunhong, HU Yunfei, SHEN Miaomiao, HUANG Depei

(DepartmentofOncology,GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the value of diagnosis and prognosis with cerebrospinal fluid flow cytometry (CSF - FCM) in non-hodgkin's lymphoma (NHL) of the central nervous system (CNS) invaded. Methods: CSF-FCM and CSF cytology were employed to detect cerebrospinal fluid (CSF) of 18 NHL patients of initial treatment, positive rate of central nervous system (CNS) involvement detected by the two methods were compared, at the same time, the correlation among clinical factors such as patients' gender, age, clinical stage, B symptoms, lactate dehydrogenase (LDH), international prognostic index (IPI) score, PS score of physical state was observed. Results: The diagnostic positive rate of CSF-FCM in detecting NHL patients with CNS invaded was higher than that of CSF-C, the difference was statistically significant (P=0.045). Single factor analysis showed that immune phenotypes of NHL which CNS invaded detected by CSF-FCM was correlated to age, B symptoms and LDH (P=0.039, 0.001 and 0.009).Conclusions: CSF-FCM immune phenotypic detection is superior to the conventional cytology when CNS involvement in NHL.

[Key words]non-Hodgkin's lymphoma; central nervous system; cerebrospinal fluid; flow cytometry; cytology

[中图分类号]R733.4

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0283-05

通信作者**E-mail:pdhuangyh@sina.com

[基金项目]*贵州省科技厅社发攻关项目[黔科合LG字(2012)063号]