糖皮质激素调节创伤后神经元胞膜钙泵研究现状

马永达，王旭辉，陈 强

1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所麻醉科，重庆 400042;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经外科，重庆 400042

交通事故伤所造成的创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)已经成为青年人致残和死亡的主要原因。脑损伤的预防和伤后救治成为一个亟待解决的问题。TBI的病理机制是一个复杂的、多重因素相互重叠、共同作用的过程。膜通透性增加、自由基损伤、兴奋性氨基酸中毒、缺血及再灌注损伤等都参与其中，而神经元胞内钙超载是上述所有致伤因素的共同通路。因此，研究创伤后神经元胞内钙代谢的变化规律，对于保护神经元功能、改善TBI的救治效果具有重要意义。笔者对糖皮质激素(glucocorticoid，GC)调节创伤后神经元胞膜钙泵的研究现状作一综述。

1 GC在TBI后脑保护中运用

GC由于其强大的抗炎、抗氧化、稳定生物膜等作用，一直被用于治疗TBI［1］，但其作用机制没有阐明。研究发现，GC可以通过不同的作用方式对神经元起到保护作用，如GC可以直接激活生长因子受体，并引发相关效应，起到神经保护作用［2-3］;促进神经保护性物质，如精氨酸和还原型谷胱甘肽的合成［4］;上调 Bcl-2、Bcl-x等保护性因子，增强神经元对抗神经毒素的能力［5］;抗炎、抗氧化;激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路(3-Akt-kinase通路)等机制，避免TBI后神经元的死亡，从而对神经元起到保护作用［6］。另外，GC调节神经元胞内钙代谢水平状况，是发挥保护作用的重要途径之一。因此，GC对生物体作用是广泛而复杂的，只有在更加详细地了解其错综复杂机制的基础上，才能在不同疾病的不同阶段正确使用，从而最大程度发挥其保护作用。

2 胞内钙超载是TBI后神经元发生损伤和凋亡的共同通路

细胞内的钙超载和平衡失调是TBI后短期内神经元坏死和凋亡的重要原因［2］，并可能与TBI后长期神经功能障碍(如突触可塑性和学习、记忆［7］)和对中枢神经系统疾病易感性增加有关［8］。既往研究曾从控制钙内流系统(主要为各种钙通道)入手改善TBI后神经元内钙离子失衡。研究显示，L型钙通道阻滞药可以在损伤后保护神经元，并且临床研究显示可以减少不良预后［1］。证明阻滞细胞钙离子的大量内流，是减少神经元钙超载，保护神经元免于死亡的途径之一。已有研究表明，钙清除系统(包括细胞膜钙泵、膜钠钙交换体、内质网钙泵和线粒体钙转运体)在细胞的损伤乃至死亡过程中同样占有重要地位，是细胞损伤及凋亡的共同通路之一［9］。有研究发现，在细胞凋亡的过程中，细胞膜上重要的钙清除分子—细胞膜钙泵(plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA)作为capase-3的底物被裂解［10］;兴奋性氨基酸中毒的损伤过程中，胞膜钙泵和胞膜的钠-钙交换体(Na-Ca exchange，NCX)可被某些蛋白酶分解，从而进一步削弱细胞维持胞浆钙离子平衡的能力，形成钙超载，最终导致细胞凋亡;而阻断PMCA和NCX的裂解则可以减少兴奋性毒素所导致的凋亡［11］。有研究发现，某些神经保护因子可以通过调整PMCA的活性，实现其神经元保护作用［6，12］，表明神经元损伤后，钙清除系统的正常运转也是防止细胞内钙超载，进而防止细胞死亡的重要因素。因此，降低 TBI后神经元胞内钙超载是保护神经元的重要措施之一。

3 GC调节TBI后神经元胞内钙超载的途径

Chen等［13］研究证实，GC可以降低创伤后神经元胞内钙超载的水平，这是GC发挥保护作用的重要途径之一。研究提示，阻断创伤后神经元钙超载这一共同通路，有可能改善创伤性神经元损伤的保护作用。

通常参与神经元胞内钙代谢的途径有PMCA、NCX、内质网钙泵(sarcoplasnic reticulum Ca2+ATPase，SERCA)和线粒体钙转运体。有研究提示，GC可以调节创伤后神经元细胞内的钙超载，主要表现为GC可以抑制某些神经递质引发的钙内流，还可以激活内质网钙泵［14］，防止胞质内钙离子过度升高;而在调节创伤后神经元胞内钙代谢时，GC是否具有主动将胞内超载的钙离子转运至胞外的能力，避免创伤后神经元胞内钙超载，进而防止神经元细胞凋亡或死亡，达到保护神经系统功能的作用，但其相关报道较少，因此有必要对其进行深入的研究。

4 GC在介导PMCA减轻神经元胞内钙超载中的作用

为了探讨GC通过介导PMCA对神经元胞质内钙瞬变的影响，Chen等［13］在前期分别用1×10-6、1×10-9mol/L的地塞米松(DEX)作用于神经元。为了最大限度地减少细胞外钙离子对观察结果的影响，Chen等［13］设计了细胞外无钙的观察条件。研究发现，1×10-6mol/L DEX能够激活PMCA，导致细胞内钙离子浓度迅速下降，而1×10-9mol/L的DEX没有这种生物效应;使用KB-R7943和毒胡萝卜素(thapsigargin)阻滞NCX和SERCA不能影响这种效应，但是用pH值8.8的细胞外液阻断PMCA后，则完全阻滞了DEX所导致的钙下降现象。提示GC导致细胞内钙离子浓度迅速下降的原因在于激活PMCA，而与NCX和SERCA的活性变化没有明显关系［13］。研究结果提示，神经元受到创伤后，胞内发生钙超载的关键因素之一可能在于PMCA的异常。

5 GC介导PMCA调节TBI后胞内钙超载机制分析

通常认为GC可以自由通过细胞膜，然后与胞质内受体及相关蛋白结合形成配体-受体复合体，再转入细胞核内与DNA某些元件结合进而调控转录过程，一般认为这个过程至少需要15 min。虽然近几年研究发现，在某些细胞内这两个过程进行是比较迅速的，但即便如此，基因组机制发生作用的时间也通常＞5 min;而GC所介导的细胞内钙离子变化是极为迅速的，认为这就是GC介导神经元胞内钙离子调节的非基因组机制［15］。非基因组机制认为，GC可以与膜相关受体结合，通过激活相应的细胞内信号通路迅速产生效应［4］。非基因组过程具有一些不同于基因组机制的特点，如不能被转录和翻译的抑制剂所阻滞，经过修饰而不能穿透细胞的GC仍能够引发相应的效应［16］。在尚未发现GC膜受体的情况下，这些特性也成为证明非基因组机制的常用方法。

GC介导的PMCA对神经元胞质内钙瞬变的调控迅速，作用时间短于传统的基因组机制，其作用机制可能在于非基因组调控机制。由GC介导的PMCA对神经元胞质内钙瞬变的调控机制研究，其相关文献报道较少，有待进一步研究。

关于TBI的体外模型，近年来由于可变形培养皿的使用，取得了许多进展。通过改变培养皿的底面积，模拟TBI状态下神经元的牵张损伤。并可通过计算机控制牵张的速度、幅度等参数，从而获得更为稳定的TBI体外模型。本研究的另一个关键是PMCA活性的测定。一般使用两种方法:(1)一种是提取然后检测 PMCA活性，这包括两种措施:①一种是从细胞匀浆中提取膜结构，联合使用多种三磷酸腺苷酶(ATP酶)抑制剂，抑制除PMCA之外所有ATP酶的活性，就可以单独测定PMCA分解底物的能力，从而鉴定其活性［17］;②另一种是从匀浆中通过亲和色谱的方法提出泵蛋白，直接检测其活性［18-19］;(2)另一种检测PMCA活性的方法是通过观察其清除胞质内钙的能力，间接确定其活性。既往研究多是通过激光共聚焦显微镜监测细胞内钙荧光变化，联合膜片钳控制细胞内钙升高的幅度，并抑制除PMCA之外所有的钙清除分子，创造一个完全由PMCA介导的钙清除过程，并以此为平台，测定各种因素对于PMCA活性的影响。这种方法的缺点是可同时观测的细胞只能为一个，样本量受到限制;而且，所需设备昂贵，不易获得。Chen等［13］曾将神经元置于无钙的缓冲液中一段时间，然后加入含钙缓冲液，能够迅速促使钙离子内流，从而使神经元内钙离子升高，并以此作为平台进行研究。

6 结语

GC对TBI后神经元具有保护作用，其作用机制是多方面的，这不仅表现在GC具有强大的抗炎、抗氧化、稳定细胞膜上，还可以通过调节神经元胞内钙代谢水平的变化，从而防止TBI后神经元发生胞内钙超载，进而达到防止神经元凋亡或坏死的作用。既往的研究主要集中于创伤后神经元的钙清除系统的异常，包括PMCA、NCX、SERCA和线粒体钙转运体的功能异常;最近则发现，应激水平的GC不仅具有主动调节PMCA从而调节胞内钙代谢，同时还具有调节TBI后神经元胞内钙超载的能力，这一系列的发现有助于进一步阐明GC对TBI后神经元保护机制，也为 TBI后合理使用GC提供理论支持。

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