响应面法优化褐藻酸降解菌的培养条件

贾 馨 媛，闫 磊，祖 国 仁

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

褐藻酸是从褐藻加碱提取出来的一种水溶性高黏度胶体，为各种褐藻所共同含有的一种细胞间多糖［1］。近年来，随着对褐藻酸的深入研究，发现褐藻酸的降解产物——褐藻寡糖具有良好的生物活性［2］，在生物材料、医药保健等领域展现了颇有前景的商业价值。褐藻寡糖具有抗癌、抗肿瘤、促进植物根系生长等多种生理功能。褐藻寡糖的众多制备方法中酶解法明显优于传统方法，具有底物特异性高、反应条件易控制、专一性强等优点。褐藻酸裂解酶来源广泛，但由于分离纯化困难、酶产量低等因素制约了实际生产利用的发展［3］，因此研究褐藻酸降解菌具有重要的意义。

本试验采用响应面法对一株褐藻酸降解菌的产酶培养条件进行优化，以期为日后大规模生产褐藻酸裂解酶和后续研究提供依据。

1 试 验

1.1 材 料

褐藻酸降解菌ZGR－13，大连金石滩海域的近海海带养殖场中腐烂的病株海带中分离得到。

种子培养基、发酵培养基：酵母膏0.1%、FeSO40.5%、NaCl 3.0%、褐藻酸钠0.5%、pH 7.2～7.5。斜面培养基：种子培养基中添加2%的琼脂粉。

1.2 方 法

1.2.1 酶活力的测定

采用DNS法检测酶活力。

酶活力单位（U）定义：在波长为520nm 处每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量。

比活力（U／mL）：每毫升发酵液所含的酶活力单位。

酶活力（U／mL）＝1 000mN／tV

式中：m为还原糖量（根据OD 值由标准曲线查得），g；N为稀释倍数；t为反应时间，15 min；V为酶液体积，0.2mL［4］。

1.2.2 菌株产酶发酵条件优化

以发酵培养基为基础培养基，将菌株接入装有5 mL 液体种子培养基的试管中，在25 ℃、150r／min摇床中培养24h，再接入装有30 mL液体培养基的100 mL 三角瓶中，在25 ℃、150r／min摇床中培养一定时间，4 ℃、8 000r／min离心15min，取上清液，用DNS法测酶活力。

1.2.3 Plackett－Burman法分析影响菌株产酶的显著因素

利用Plackett－Burman法对各因素进行考察［5］。每个因素选取两水平，响应值为酶活力（Y）［6］。

1.2.4 最陡爬坡试验

根据Plackett－Burman试验找到关键因素由试验结果拟合得到一阶模型回归系数的符号和大小确定因素水平的增减，逼近酶活最高区域［7］。

1.2.5 Box－Behnken设计及响应面分析

根据最陡爬坡试验结果，借助 Design expert 6.0软件［8］进行Box－Behnken 设计，建立有效响应曲面拟合方程并分析结果，实现对培养条件的进一步优化。最终通过优化试验获得的试验结果与模型进行拟合，验证模型的可靠性［9］。

2 结果与讨论

2.1 Plackett－Burman确定影响产酶的关键因素

确定Plackett－Burman试验设计的因素及水平，以测得的粗酶液的酶活平均值为响应值Y，选择培养基的碳源、氮源、混合碳源、酵母膏含量、FeSO4、NaCl、接种量、装液量八因素作考察对象，Plackett－Burman试验设计及响应值见表1和2。

表1 试验因素与水平Tab.1 List of levels and factors

表2 Plackett－Burman试验设计Tab.2 Design of Plackett－Burman experiment

表3为单因素方差分析，由表3可以看出，该模型的p值为0.045 4，说明筛选模型显著，仅有4.54%的概率不能使用该模型解释。利用Plackett－Burman设计优化培养条件的重要因素具有统计学意义。通过p值可以看出，对产酶有显著作用的有2个因素（p≤0.05）：氮源添加量与酵母膏添加量。据已选的Plackett设计试验因素组合和试验组数如表2所示。

表3 单因素方差分析Tab.3 Analysis of selected factorial model

2.2 最陡爬坡试验

以玉米浆（X1）、酵母膏（X2）为自变量，酶活力为因变量。由表4可知，酶活力最高点在试验4和试验5之间。

表4 最陡爬坡试验设计Tab.4 The design and results of steepest ascent test

2.3 响应面法优化培养条件

根据表4试验结果，第4组与第5组数据取平均值进行中心组合试验，设计因素与水平及中心组合试验设计如表5和6所示。

表5 试验因素与水平Tab.5 List of levels and factors

表6 中心组合试验设计Tab.6 Design and result of CCD

由软件分析得模型的拟合度（R2）＝0.902 8，说明该模型在90%水平上能够拟合试验数据。模型的信噪比为8.029，一般模型信噪比大于4模型较好，CV值（%）较低，为7.9，说明试验操作可信度较高。得到回归方程：Y＝0.25＋0.020X1＋0.012X2＋0.020X1X2－0.029X2－0.034X2变量系数为正值，表示该变量正向变化可使得响应值增加；二次项系数为负值，表示方程的抛物面开口冲下，有极大值点，可以进行最优分析。响应面分析结果见表7，响应曲面图可预测检测变量的响应值与确定变量的相互作用形式如图1所示。

表7 交互因素方差分析Tab.7 ANOVA for response surface quadratic model

图1 玉米浆（X1）和酵母膏（X2）对菌株产酶活力的影响Fig.1 Effects of yeast extract and corn steep liquor on enzyme production

2.4 最佳产酶条件

最优回归方程求偏导数得出酶活力达最大值时X1＝1.85，X2＝0.92，即条件为氮源1.85%，酵母膏0.92%，褐藻酸钠0.4%，NaCl 3%，FeSO40.01%，混合碳源3%，接种量9%，装液量30mL，试验得到最大酶活57.61U／mL。

3 结 论

褐藻酸降解菌的开发和应用是实现海洋资源高值化应用的一项核心技术。本研究通过响应面分析法优化了该株褐藻酸降解菌ZGR－13的最适培养条件。在最适条件下，菌株的最大酶活理论上可达57.61U／mL。本研究有效筛选出了主要的影响因素，避免了非主要因素可能带来的时间和资源浪费，为褐藻酸酶的分离纯化及制备酶解产物提供了实验基础及理论依据。目前，国际市场上商品化的褐藻酸裂解酶制剂及其降解产物仍然空白。随着研究的深入，褐藻酸降解菌在新药开发、新型功能产品及新生化制品的研制将发挥重要作用。

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