一株蛋白水解酶产生菌的分离鉴定及发酵产酶条件优化

郭 文 坛，王 艳，叶 方，张 春 枝

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

蚕丝主要是由外层的丝胶和内层的丝素组成。丝胶覆于丝素的外围，对丝素起到了保护和胶结的作用［1－2］。同时，过多的丝胶会影响蚕丝的手感和光泽。因此，蚕丝必须经过脱胶才能用到织物服装中。目前国内外蚕丝脱胶方法多为碱煮法［3－4］，但因其工艺复杂烦琐、成本高、效率低、产品质量差和污染环境等因素影响了丝胶的开发与利用。

蛋白酶具有反应条件温和、高效专一、产量高和循环使用无污染等优点，引起了诸多学者的广泛研究［5－6］，生物法脱胶已是现阶段人们关注的重点［7］。张雨青［8］的研究证明了生物法脱胶具有一定的优势。张胡静等［9］进一步解释了生物法脱胶在蚕丝加工过程中的重要性。利用生物法对蚕丝蛋白进行水解，对食品和医疗保健品行业以及纺织工业具有深远的意义［10－11］。

本研究旨在从养殖柞蚕周边的土壤中分离筛选出能够生产蛋白水解酶的菌株并对其进行菌种的初步鉴定以及发酵条件优化，从而获得一株具有较高竞争力和使用开发价值的蛋白水解酶产生菌，以期实现柞蚕壳的生物脱胶，并对菌株产酶的最佳发酵条件进行初步的探索。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种来源

采集柞蚕生产基地周围10cm 以下的土壤样品，样品密封备用。

1.1.2 培养基

富集培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，pH 7.0，121 ℃灭菌20min。

筛选培养基：酪蛋白1.0%，磷酸二氢钾0.03%，七水合硫酸镁0.05%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%，pH7.0，121 ℃灭菌20min。

种子培养基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1.0%，pH 7.0，121℃灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖4.0%，蛋白胨5.0%，磷酸二氢钾0.03%，氯化钠0.5%，pH 7.0，121 ℃灭菌20min。

1.1.3 主要试剂

生物试剂：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物、酪蛋白，琼脂，福林酚试剂。

葡萄糖、蔗糖、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼砂、硼酸、三氯乙酸，均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 蛋白水解酶产生菌的初筛

将样品接种于富集培养基上，进行隔夜培养，再利用稀释涂布法［12－13］将菌液涂布到筛选培养基上，于37 ℃培养48h，挑选出菌落周围产生较大透明圈的菌株，并记录各挑选菌株的菌落与透明圈的直径。

1.2.2 蛋白水解酶产生菌的复筛

将初筛步骤中挑选出来的菌株进行种子液制备，然后再接种到100mL发酵培养基中，于37℃发酵72h后，取10mL发酵液进行离心（5 000r／min，10min），上清液即为粗酶液。同时测定上清液的蛋白酶的活力。

1.2.3 菌种鉴定与生理生化特征

菌株的形态特征与生理生化特征鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》。

1.2.4 16SrDNA 序列分析与比对

16SrDNA 基因测序委托宝生物工程（大连）有限公司完成。测序序列与Ezbiocloud 网站数据库中的已知序列进行比对。

1.2.5 蛋白酶活力的测定

采用中华人民共和国专业标准《蛋白酶活力测定法》SB／T 10317—1999进行蛋白酶活力的测定。蛋白酶活力定义为在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。

1.2.6 产酶发酵条件优化

通过筛选选定一株最优菌株，对其进行产酶发酵条件的优化研究。通过改变培养基的相关组分即碳源、氮源和初始pH 来优化发酵培养基，改变发酵温度、发酵时间和接种量等条件考察其对菌株产酶量的影响。

2 结果与分析

2.1 蛋白水解酶产生菌的筛选

通过筛选培养基共筛选出5株周围具有蛋白水解透明圈的菌株，经发酵培养基发酵后，分别测定菌株的蛋白酶活力，结果见表1。

表1 5种不同菌株发酵后菌落直径比与蛋白酶活力Tab.1 The diameter ratio and enzyme activity of five different strains after fermentation

表1结果显示，G1菌株的透明圈与菌落的直径比和酶活力均为最大。因此，选择G1 菌株作为出发菌株研究其产酶条件。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 生理生化特征

G1菌株的菌落形态特征及生理生化特征表明，G1菌株为革兰氏染色阴性杆菌，菌落为黄色圆形，乳脂状，表面光滑隆起，边缘整齐，易挑取。菌落形态如图1所示。该菌为好氧菌，耐氯化钠的质量分数为7%。同时该菌能利用淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、纤维二糖、半乳糖和山梨酸等多种碳源，同时能够利用蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等氮源，能够分解酪蛋白和明胶。

图1 G1菌株在酪蛋白平板上的菌落形态Fig.1 The colony morphology of strain G1on casein plate

2.2.2 16SrDNA 序列分析与比对

G1菌株的序列在数据库比对分析后得到与其16SrDNA 匹配相似性较高的序列分布，选取匹配相似性在98%以上的序列如表2 所示。结合该菌株的形态特征和生理生化特征分析结果，初步确定G1菌株为Luteibacteranthropi。

表2 序列比对结果Tab.2 Results of sequence alignment

2.3 发酵培养基的优化

2.3.1 碳 源

在发酵培养基中分别加入4.0%葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖和麸皮4种碳源，其他发酵条件保持一致，37 ℃发酵72h，随后测定发酵液的酶活，结果如图2所示。图2表明，当葡萄糖为碳源时，测得发酵液的酶活最高。分析结果认为，葡萄糖作为单糖能够直接被菌体吸收利用，发酵液的酶活表现最高，因此选定葡萄糖为G1菌株发酵培养基的最佳碳源。

图2 碳源对G1菌株产酶的影响Fig.2 The effects of carbon resources on enzyme production by strain G1

2.3.2 氮 源

将G1菌株的种子液以3.0%接种量分别接种到以5.0%蛋白胨、牛肉膏、硝酸钠、硫酸铵和豆饼粉为氮源，4.0%葡萄糖为碳源的发酵培养基中，37 ℃发酵72h，测定发酵液的酶活，结果如图3所示。

图3 氮源对G1菌株产酶的影响Fig.3 Effects of nitrogen resources on enzyme production by strain G1

图3结果表明，在碳源相同时，以5.0%蛋白胨为氮源时的酶活最高。因此选定蛋白胨为G1菌株发酵培养基的最佳氮源。

2.3.3 初始pH

将G1菌株分别接种在以4.0%葡萄糖为碳源、5.0%蛋白胨为氮源，pH 分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0和12.0的培养基中，37℃发酵72h。测定发酵液的酶活，结果如图4所示。

图4 起始pH 对G1菌株产酶的影响Fig.4 Effects of initial pH on enzyme production by strain G1

图4结果表明，在保证发酵培养基的碳源和氮源不变的前提下，培养基的初始pH 为8.0时，酶活达到最高。

2.4 发酵条件的优化

2.4.1 发酵温度

将G1 菌株接种于以4.0%葡萄糖为碳源，5.0%蛋白胨为氮源，初始pH 为8.0的发酵培养基中，分别置于22，27，32，37，42，47，52，57，62，67 ℃下发酵72h，测定蛋白酶活力，研究不同发酵温度对产酶结果的影响，结果见图5。

图5 发酵温度对G1菌株产酶的影响Fig.5 The effects of temperature on enzyme production by strain G1

由图5可以看出，当其他条件相同时，随着温度的升高，发酵液的酶活逐渐升高。当温度达到47 ℃时酶活达到最大，随着温度的继续增加，酶活显著下降。可见，G1菌株能够适应较高的发酵温度，47 ℃为G1菌株的最佳发酵温度。

2.4.2 不同发酵时间对产酶结果的影响

将G1 菌株接种于以4.0%葡萄糖为碳源，5.0%蛋白胨为氮源，初始pH 为8.0的发酵培养基中，发酵温度为47 ℃，分别发酵24，48，72，96，120h，发酵结束后分别测定蛋白酶活力，结果如图6所示。

图6 发酵时间对G1菌株产酶的影响Fig.6 Effects of time on enzyme production by strain G1

图6结果表明，随着发酵时间的增加，发酵液的酶活逐渐增大，当发酵时间达到96h，蛋白酶活力达到最大值，随着发酵时间的逐渐延长，发酵液的酶活呈下降趋势。因此选择最优发酵时间为96h。

2.4.3 接种量

将G1菌株的种子发酵液按1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%的接种量接种于以4.0%葡萄糖为碳源，5.0%蛋白胨为氮源，初始pH 为8.0的发酵培养基中，在47℃下培养96h，测定蛋白酶活力，结果如图7所示。

图7 接种量对G1菌株产酶的影响Fig.7 Effects of G1inoculum volume on enzyme production

图7结果表明，随着接种量的增加，发酵液的酶活力逐渐增加，当接种量为4.0%时蛋白酶活力达到最大；随着接种量的不断增加，发酵液的酶活力没有继续增加，反而呈下降趋势。因此选择4.0%为G1菌株的最佳接种量。

3 讨 论

本研究从养殖柞蚕的生产基地周围的土壤中筛选出一株能够产生蛋白水解酶的菌株G1。在筛选过程中，利用以酪蛋白为唯一碳源和唯一氮源的筛选平板，能更具有针对性地筛选出产生蛋白水解酶的菌株。同时依据其形态特征、生理生化特征以及16SrDNA 序列比对进行分析，初步鉴定该菌株为Luteibacteranthropi。实验结果表明，以4.0%葡萄糖为碳源、5.0%蛋白胨为氮源和初始pH 为8.0的发酵培养基，47 ℃下发酵96h，产酶量达到最大值，为1 520U／mL。

［1］吴坚，吕丽华，徐建平.柞蚕丝织物的柔软整理方法分析［J］.大连工业大学学报，2009，28（3）：232－234.（WU Jian，LV Lihua，XU Jianping.Study on methods of softening tussah fabrics［J］.Journal of Dalian Polytechnic University，2009，28（3）：232－234.）

［2］陈华，朱良均，闵思佳，等.蚕丝丝胶蛋白的结构、性能及利用［J］.功能高分子学报，2001，14（3）：344－348.

［3］王勇，杜凌云，程霜.蚕丝脱胶工业条件的探讨［J］.聊城师院学报：自然科学版，1999（1）：40－44.

［4］张显华，左保齐.桑蚕丝脱胶试验研究［J］.丝绸，2008（10）：33－34.

［5］张竹慧，罗玮，顾秋亚，等.1株角蛋白酶产生菌的筛选、鉴定与产酶特性研究［J］.江苏农业科学，2013（3）：315－318.

［6］夏伟，闫志勇，朱绍辉，等.一株产蛋白酶海洋菌的筛选、鉴定及培养条件优化［J］.中国农学通报，2012，28（20）：154－158.

［7］吴焕岭.蚕丝织物的蛋白酶脱胶工艺［J］.印染，2013（16）：20－22.

［8］张雨青.蚕丝脱胶方法的比较分析［J］.蚕丝科学，2002，28（1）：75－79.

［9］张胡静，谢洁，徐水.微生物酶在蚕丝加工中的应用［J］.丝绸，2009（1）：42－44.

［10］胡学智，王俊.蛋白酶生产和应用的进展［J］.工业微生物，2008，38（4）：49－61.

［11］李佳，刘克武.微生物碱性蛋白酶研究进展［J］.四川食品和发酵，2004，40（1）：6－8.

［12］杨文博.微生物学实验［M］.北京：化学工业出版社，2004：52－75.

［13］余龙江.发酵工程原理与技术应用［M］.北京：化学工业出版社，2008：15－20.