甲状腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表达及临床意义

张　伟，李　娟，丁　海，张学义

(抚顺矿务局总医院 病理科，辽宁 抚顺113008)

甲状腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表达及临床意义

张伟*，李娟，丁海，张学义

(抚顺矿务局总医院 病理科，辽宁 抚顺113008)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0369)

自噬是一种细胞生物学过程，细胞通过内质网[1]或高尔基体[2]与溶酶体结合，降解细胞自身的陈旧蛋白及细胞器等过程，实现细胞本身代谢的需要及细胞器的更新。细胞通过自噬适应环境变化、维持内环境稳定[3，4]，得以生存或自噬性死亡。大量的研究表明，自噬活性的改变与多种肿瘤有关。Beclin-1是一种抑癌基因，它可以调节自噬水平，在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。PTEN蛋白是和张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)，近年来发现PTEN基因的缺失和突变与许多恶性肿瘤密切相关。本研究采用免疫组织化学方法检测正常甲状腺组织和甲状腺癌组织中Beclin-1、PTEN蛋白的表达情况，探讨Beclin-1蛋白、PTEN蛋白在甲状腺癌发生、发展中的作用及相互间的关系。

1材料与方法

1.1材料随机选取抚顺矿务局总医院2012年至2013年，手术切除的65例甲状腺癌组织的存档蜡块。其中男性18例，女性47例；年龄17-62岁，平均年龄45岁，≥45岁者20例，<42岁者45例；甲状腺乳头状癌32例，滤泡癌12例，髓样癌11例，未分化癌10例；有淋巴结转移者39例，无淋巴结转移者26例；按2010年AJCC第七版的TNM分期标准分为：Ⅰ-Ⅱ期44例，Ⅲ-Ⅳ期21例。另随机选取同期甲状腺腺瘤腺叶切除术后瘤旁至少0.5 cm正常甲状腺标本25例作为对照。每例均有详细的临床病理资料，所有病例术前未进行放疗、化疗和免疫治疗。所有标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋、切片。

1.2试剂与方法鼠抗人Beclin-1单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，鼠抗人PTEN单克隆抗体为福州迈新生物技术开发有限公司产品。采用免疫组织化学SP法对甲状腺癌组织中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白进行检测，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，用已知阳性的切片做阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。

1.3结果判定采用双盲法随机选取10个高倍视野(×400)，每个高倍视野计数100个肿瘤细胞。观察阳性细胞所占的百分数及染色强度。对阳性细胞所占的百分数计分，以百分数<5%=0分、5%-25%=1分、26%-50%=2分、51%-75%=3分、>75%=4分。同时以染色强度无色=0分、淡黄色=1分、棕黄色=2分、深棕色=3分进行评分。最后累积积分大于3分为阳性表达，否则视为阴性表达。Beclin-1蛋白阳性颗粒为棕黄色，定位于细胞质，PTEN蛋白阳性颗粒为棕黄色，定位于细胞核。

1.4统计学分析应用SPSS18.0统计软件包进行统计，采用卡方检验(χ2)及Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌和正常甲状腺组织中的表达Beclin-1蛋白主要表达于细胞浆内(图1)，在甲状腺癌组织中的表达阳性率低于正常甲状腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN蛋白主要表达于细胞核(图2)，在甲状腺癌组织中的表达阳性率低于正常甲状腺组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1　Beclin-1蛋白在甲状腺乳头状癌中的细胞质表达

图2　PTEN蛋白在甲状腺乳头状癌中的细胞核表达

组别例数Beclin-1蛋白阳性例数(%)χ2值P值PTEN蛋白阳性例数(%)χ2值P值正常甲状腺组织2520(80.00)16.56<0.0522(88.00)23.76<0.05甲状腺癌组织6521(32.30)20(30.76)

2.2Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表达与甲状腺癌临床病理因素的关系Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表达与甲状腺癌患者的年龄、性别、组织学类型均无明显相关性(P>0.05)；Beclin-1蛋白的表达与甲状腺癌有无淋巴结转移相关(P<0.05)，PTEN蛋白的表达与甲状腺癌的有无淋巴结转移、TNM分期相关，随着淋巴结转移、TNM分期越晚，PTEN蛋白的阳性表达率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表达与甲状腺癌临床病理因素的关系

2.3Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌组织中表达的相关性Spearman等级相关分析显示，Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌组织中的表达呈轻度正相关(r=0.21，P<0.05)。见表3。

表3　Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌组织中

3讨论

近几年来，甲状腺癌的发病率逐年上升，据统计2012年已排入我国恶性肿瘤发病率的前十名。甲状腺癌起病隐匿，预后很好，经过规范治疗，即使有颈部淋巴结转移，其5年生存率可达到97%；但是已有远处转移者，则预后较差。早期诊断并规范治疗才能保证甲状腺癌的最佳预后。本研究通过Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况进行分析，了解二者在甲状腺癌的发生、发展过程中的作用机制，为甲状腺癌的早期诊断、判断预后及生物靶向治疗提供参考的依据。

Beclin-1是一种与抑癌基因，与酵母菌Atg6同源，是第一个被发现的参与自噬过程的基因，是由Liang等[5]于1998年被发现并命名，1999年由Aita等[6]成功克隆，该基因位于人类染色体17q21上，有12个外显子，11个内含子。适度的自噬可以使细胞得以生存，过度自噬则引起细胞的自噬性死亡。Beclin-1蛋白在细胞自噬过程中起到重要作用，研究表明，Beclin-1蛋白在肺癌[7]、卵巢癌[8]、脑瘤[9]中低表达，在胃癌[10]、肝癌[11]中高表达，Beclin-1蛋白在不同的肿瘤细胞中发挥不同的作用。本研究结果显示Beclin-1蛋白在甲状腺癌中的表达低于正常甲状腺组织，并且在有淋巴结转移组的表达低于无淋巴结转移组，提示Beclin-1蛋白与甲状腺癌的发生、发展相关，其机制可能为：Beclin-1蛋白的表达下调，降低细胞的自噬反应，不能够诱导自噬性肿瘤细胞死亡，从而促进肿瘤的发生和发展；Beclin-1蛋白可以通过促进细胞的凋亡，对肿瘤起到抑制的作用；Beclin-1蛋白还可以影响VEGF和HIF-2α，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和肿瘤新血管的生成，阻止肿瘤的进展。

PTEN是一种抑癌基因，亦称MMAC1或TEP1。是1997年由Li等[12]克隆并命名的，是目前唯一一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移过程中起到重要作用[13]。本研究结果显示PTEN蛋白在甲状腺癌组织中的表达阳性率低于正常甲状腺组织，提示其在甲状腺癌的发生过程中起重要作用，机制可能为PTEN蛋白诱导细胞周期的阻滞，通过PI3K途径和MAPK途径来调控细胞周期[14-15]，使细胞无限增殖，形成肿瘤[16]；PTEN基因的突变可以导致AKT通路的激活和抑制细胞的自噬[17]，促进肿瘤的发生。本研究结果还显示PTEN蛋白在甲状腺癌中的表达随着淋巴结转移、TNM分期越晚PTEN蛋白的阳性表达率降低。与国内李茂竹等[18]研究一致，提示PTEN蛋白与甲状腺癌的发展密切相关，其机制可能为PTEN蛋白使FAK去磷酸化，阻止肿瘤细胞的侵袭和转移[19]，PTEN蛋白可以调节FAK和Shc的磷酸化，对细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用进行调控，影响肿瘤细胞的粘连和转移[20]。

Beclin-1和PTEN都是抑癌基因，都能够在肿瘤的发生和发展过程中起到阻抗作用，本研究发现二者在甲状腺癌中的表达成正相关，与李捷等[21]的研究一致。提示甲状腺癌的进展过程中存在内在联系，PTEN蛋白是ClassI PI3K活性的的负调控因子，可水解3，4，5一三磷酸肌醇，使有PH同源结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶AKT(也称PKB)被脱磷酸化而活化，降低 PKB/AKT 的磷酸化水平，解除ClassI PI3K/PKB的抑制作用，促进自噬的发生。Beclin-1蛋白和PTEN蛋白共同参与细胞的自噬，可能分别在自噬体形成和信号调控水平来进行调节，在甲状腺癌的发生、发展中发挥作用。

综上所述Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌的发生、侵袭和转移密切相关，二者联合检测，可以作为评估甲状腺癌预后的指标。 深入研究二者在细胞自噬及甲状腺癌中的作用机制，为甲状腺癌的靶向治疗提供理论依据。

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摘要：目的探讨Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲状腺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学SP法检测65例甲状腺癌及25例正常甲状腺组织中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表达，并对其与性别、年龄、病理学分型、TNM分期及淋巴结转移的关系进行分析。结果65例甲状腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的阳性表达率均低于二者在正常甲状腺组织中的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。在甲状腺癌中Beclin-1蛋白在伴淋巴结转移组阳性率20.5%低于不伴淋巴结转移组50.0%；PTEN蛋白在伴淋巴结转移组阳性率20.5%低于不伴淋巴结转移组46.2%；在TNM为Ⅲ、Ⅳ期组阳性率14.3%低于Ⅰ、Ⅱ期组的阳性率38.6%(P<0.05)。Beclin-1蛋白和PTEN蛋白表达之间呈正相关。结论Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的低表达与甲状腺癌的发生、发展相关，二者联合标记可能作为评估甲状腺癌恶性程度及预后的有效指标，并可能为其靶向治疗提供思路。

关键词：甲状腺癌；Beclin-1蛋白；PTEN蛋白； 免疫组织化学

Expression and clinical significance of Beclin-1 and PTEN proteins in thyreoid carcinomaZHANGWei，LIJuan，DINGHai，etal.(DepartmentofPathology，GeneralHospitalofFushunMiningBureau,Fushun113008，China)

Abstract:ObjectiveThe study investigated the expressions and significance of Beclin-1 and PTEN proteins in thyreoid carcinoma.MethodsThe expressions of Beclin-1 and PTEN proteins were detected in 65 cases of thyroid carcinoma and 25 cases of normal thyroid tissues by immunohistochemistry(streptavidine-peroxidase method)，and meanwhile，compared with sex，age，pathology subtypes，TNM stages and lymph node metastasis of thyroid carcinoma.ResultsThe expression rate of Beclin-1 and PTEN proteins in thyroid carcinoma was significantly lower than that in normal thyroid tissues，and the difference was statistically significant(P<0.05)；The positive expression rate of Beclin-1 protein in the patients with lymph node metastasis(20.5%)was significantly lower than those without lymph node metastasis(50.0%);The positive expression rate of PTEN protein in the patients with lymph node metastasis20.5%was significantly lower than those without lymph node metastasis46.2%;TNM stage Ⅲ、Ⅳ14.3% was significantly lower than TNM stage Ⅰ、Ⅱ38.6%(P<0.05),The expressions of Beclin-1 protein was positively correlated to that of PTEN protein in thyreoid carcinoma.ConclusionThe down-regulation of Beclin-1 and PTEN proteins may be associated with thyroid carcinoma．Joint marking these two genes may offer a effective reference for evaluation of malignant degree and prognosis of thyroid cancer and may even afford a mentality to the targeted therapy．

Key words:thyreoid carcinoma;Beclin-1 protein;PTEN protein;immunohistochemistry

收稿日期：(2014-03-09)

作者简介：张伟(1974-)，男，辽宁锦县人，副主任医师，硕士学位，研究方向：肿瘤病理学研究。

文献标识码：A

中图分类号：R736.1

文章编号：1007-4287(2015)03-0369-04

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