肿瘤坏死因子-α在七氟醚后处理减轻体外循环犬肺损伤中的作用



基础医学研究

肿瘤坏死因子-α在七氟醚后处理减轻体外循环犬肺损伤中的作用

谢菲1，李冬冬2，罗俊丽3，何苗1，张红1

(1.遵义医学院 贵州省麻醉学研究生教育创新基地暨贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州 遵义563099；2.益都中心医院，山东 潍坊261000；3.遵义医学院附属医院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 通过观察七氟醚后处理对体外循环(CPB)犬肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响，探讨七氟醚后处理减轻CPB肺损伤的机制。方法 健康杂种犬18只随机分为3组，每组6只(n=6)：单纯手术组(A组)、体外循环缺血再灌注组(B组)、七氟醚后处理组(C组)。3组犬麻醉固定后，行双腔气管插管机械通气。经胸骨正中切口开胸，B、C组建立犬体外循环单肺缺血再灌注损伤模型。C组在开放左肺动脉即刻通过人工膜肺给予呼气末2%七氟醚后处理30 min，A组只开胸，不做其他处理。B、C组CPB前(T1)、开放左肺动脉后(T2)及实验结束时(T3)；A组与B、C组相同时间的3个时间点抽取股动脉血行血气分析计算氧合指数(OI)和呼吸指数(RI)；取左肺组织保存，HE染色光镜观察形态学变化；采用ELISA法检测肺组织TNF-α的含量。结果 ①肺功能指标的变化：3组内不同时点比较结果发现，A组各时点OI、RI未见明显改变(P>0.05)，B、C组T1~T3时点OI逐渐降低，而RI则逐渐升高(P<0.05)。3组间同时点比较结果显示，T1时刻，3组犬之间OI、RI无明显差异(P>0.05)；T2、T3时刻，与A组比较，B、C组OI显著减低，RI则明显升高(P<0.05)，其中C组在T3时刻OI明显高于B组，而RI则相反(P<0.05)。②肺组织光镜形态学观察：各组T1~T3时点，肺组织结构损伤逐渐加重。T3时刻A组肺组织损伤程度较B、C组轻，而C组又明显较B组轻。③肺组织TNF-α含量的变化：3组内各时点比较结果显示，A组各时点肺组织TNF-α含量未见明显改变(P>0.05)；B、C组T1~T3时点肺组织TNF-α含量逐渐增加(P<0.05)。3组间同时点比较结果显示，T1时刻3组犬肺组织TNF-α含量无明显差异(P>0.05)；T2、T3时刻，与A组比较，B、C组肺组织TNF-α含量明显增加(P<0.05)，其中C组在T3时刻TNF-α含量明显低于B组(P<0.05)。结论 CPB后随着犬肺组织TNF-α含量的增加，肺组织结构破坏严重，肺功能降低，肺组织TNF-α含量的增加可能是加重肺损伤的重要原因。七氟醚后处理后肺功能明显改善，肺组织破坏程度减轻，对CPB犬肺损伤有一定保护作用。七氟醚后处理减轻CPB肺损伤的作用可能与抑制肺组织TNF-α表达有关。

[关键词]TNF-α；七氟醚后处理；体外循环；肺损伤

体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)后肺损伤是心脏手术最常见的并发症，尤其是老年人和婴儿，由此导致的肺功能障碍已成为术后死亡的主要原因之一[1]。如何减轻CPB肺损伤，降低心脏手术的死亡率，一直是人们研究的热点。CPB引发的全身性炎症反应是肺损伤最重要的因素，CPB过程中肺缺血/再灌注损伤、补体系统的激活、内毒素血症和炎症因子相互作用都可导致炎症“瀑布”效应的发生，大量激活中性粒细胞使其在肺组织内聚集活化，产生大量氧自由基直接破坏肺泡上皮细胞和内皮细胞，破坏肺组织正常结构，其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)在炎性反应中发挥着重要作用[2]。七氟醚是一种卤素类吸入麻醉药，研究发现，0.5%~3%浓度七氟醚后处理能改善脂多糖诱导肺损伤的气体交换功能并减轻肺组织损伤[3]。七氟醚可改善肺功能，对肺损伤有一定的保护作用，但具体机制不清。本研究是通过观察七氟醚后处理对CPB犬肺组织TNF-α表达的影响，来探讨其减轻CPB肺损伤的机制，为CPB中的肺保护提供新的手段，也为拓展七氟醚的用途提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物与分组健康成年杂种犬18只，体重10~15 kg，雌雄不拘，由遵义医学院动物实验中心提供。随机分为3组(n=6)，单纯手术组(A组)：犬麻醉固定，双腔插管，机械通气，开胸，分离左肺动脉，不做任何处理直至实验结束；体外循环缺血再灌注组(B组)：建立CPB左肺缺血再灌注损伤模型[4]；七氟醚后处理组(C组)：建立CPB左肺缺血再灌注损伤模型，于开放左肺动脉即刻通过人工膜肺给予2%七氟醚后处理30 min，其余步骤同B组。

1.2模型制备和分组处理3组犬腹腔内注射2.5%戊巴比妥25 mg/kg麻醉后，仰卧位固定，行双腔气管插管，连接麻醉机行机械通气，维持潮气量12~15 mL/kg，呼吸频率16次/min，I∶E=1∶2，FiO2∶99%。股动脉穿刺置管，监测MAP；股静脉中心静脉穿刺置管，监测CVP和术中补液；同时监测HR、舌黏膜氧饱和度(SpO2)及鼻咽温度(T)。经胸骨正中切口开胸，右心房内注入肝素3 mg/kg，肝素化后行升主动脉和右心房插管，连接人工心肺机及CPB管道，建立犬CPB。待ACT大于480 s后开始CPB转流，并行循环10 min后阻断左肺动脉，行右侧单肺通气。并行循环60 min后，开放左肺动脉恢复左肺机械通气，继续并行循环30 min后停CPB，停机时用鱼精蛋白(1∶1.5)中和肝素，充分止血，拔出CPB管道，机血回收后回输犬体内，维持循环稳定2 h后实验结束。CPB期间维持平均动脉压在50~80 mmHg，灌注流量在100~120 mL/kg/min，通过动脉血气分析来调整酸碱及电解质平衡。C组于开放左肺动脉时通过人工膜肺给予七氟醚处理(呼气末浓度为2%)30 min，其余步骤同B组。

1.3指标的检测B、C组CPB前(T1)、开放左肺动脉后(T2)及实验结束时(T3)；A组与B、C组相同时间的3个时间点取股动脉血行血气分析，取左肺组织，并将每个时间点的组织分为2份保存，一份用于病理学观察，另一份用于TNF-α含量测定。

1.3.1肺功能测定根据动脉血气分析结果计算氧合指数(OI)、呼吸指数(RI)：OI(氧合指数)= PaO2/FiO2，RI(呼吸指数)=P(A-a)O2/PaO2。

1.3.2病理学观察3组分别于T1、T2、T3时刻取犬左肺组织10%福尔马林固定，制作石蜡切片，行HE染色后封片，在100倍光学显微镜下观察肺组织形态，并拍摄保存图片。

1.3.3肺组织TNF-α含量测定采用ELISA法检测。3组分别于T1、T2、T3时刻取犬左肺组织称重，取缓冲液，以1/9容量比配置，匀浆，离心后取上清液-80 ℃保存，严格按照TNF-α酶联免疫试剂盒(RD公司，美国)说明书的步骤进行操作。

2结果

2.1一般资料3组犬体重、体表面积、并循时间、左肺动脉阻断时间、CPB时间、灌注液体量以及最低鼻咽温度等比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2氧合指数变化3组内不同时点比较：与T1时点比较，T2、T3时刻B、C组OI显著降低(P<0.05)，A组未见明显改变(P>0.05)；与T2时刻比较，T3时刻B、C组OI明显降低(P<0.05)，A组未见明显改变(P>0.05)。3组间同时点比较：T1时刻，3组犬之间OI无明显差异(P>0.05)；T2时刻，与A组比较，B、C组OI显著减低(P<0.05)；T3时刻，B、C组OI低于A组(P<0.05)，C组OI明显高于B组(P<0.05，见表1)。

组别氧合指数T1T2T3呼吸指数T1T2T3A464.67±17.56430.75±15.33415.67±15.430.298±0.0160.348±0.0330.363±0.034B457.50±20.71373.33±20.06#◆234.33±22.69#※◆★0.283±0.0241.070±0.040#◆3.257±0.044#※◆★C466.33±18.36376.33±16.10#◆321.67±11.30#※◆0.291±0.0211.115±0.094#◆1.815±0.057#※◆

与T1比，#P<0.05；与T2比，※P<0.05；与A组比，◆P<0.05；与C组比，★P<0.05。

2.3呼吸指数变化3组内不同时点比较：与T1时点比较，T2、T3时刻B、C组RI显著升高(P<0.05)，A组未见明显改变(P>0.05)；与T2时刻比较，T3时刻B、C组RI明显升高(P<0.05)，A组未见明显改变(P>0.05)。3组间同时点比较：T1时刻，3组犬之间RI无明显差异(P>0.05)； T2时刻，与A组比较，B、C组RI显著升高(P<0.05)；T3时刻，B、C组RI高于A组(P<0.05)，C组RI明显低于B组(P<0.05，见表1)。

2.43组犬肺组织病理学变化T1时刻，3组犬肺组织结构完整清晰，肺泡壁光滑、完整，肺泡腔内未见明显出血及炎性渗出。T2时刻，B、C组犬肺组织结构稍紊乱，可见部分肺泡壁断裂，少量炎性细胞渗出及红细胞漏出，A组无明显变化。T3时刻，A组肺组织结构较清晰，见少量肺泡壁断裂及炎性渗出；B组肺组织结构紊乱，肺泡壁断裂较重，部分肺泡腔塌陷，肺泡腔和肺间质可见大量炎性细胞浸润和少量红细胞漏出；C组肺组织结构尚清晰，部分肺泡腔塌陷，肺泡壁断裂，可见少量炎性细胞渗出及红细胞漏出，肺损伤程度明显较B组轻(见图1)。

A:A组T1;B:B组T2;C:C组T2；D：A组T3;E:B组T3;F:C组T3。图1　各时点3组犬左肺组织病理学的变化(×100)

2.53组犬肺组织TNF-α含量变化3组犬不同时间点之间比较：A组各时点肺组织TNF-α含量未见明显改变(P>0.05)；与T1比较，T2、T3时刻B、C组肺组织TNF-α含量明显增加(P<0.05)；与T2时刻比较，T3时刻B、C组犬肺组织TNF-α含量明显升高(P<0.05)。3组犬同时间点比较：T1时刻3组犬肺组织TNF-α含量无明显差异(P<0.05)；T2时刻：与A组比较，B、C组肺组织TNF-α含量明显增加(P<0.05)；T3时刻，B、C组肺组织TNF-α含量明显高于A组(P<0.05)，C组TNF-α含量明显低于B组(P<0.05，见表2)。

组别T1T2T3A19.4967±1.534926.7367±1.663629.4470±2.4512B22.8533±2.319642.9233±4.4244#◆70.3467±5.7087#※◆★C24.0733±3.005143.1200±2.2255#◆55.9233±4.6555#※◆

与T1比，#P<0.05；与T2比，※P<0.05；与A组比，◆P<0.05；与C组比，★P<0.05。

3讨论

本次实验参照游露等[4]已成功建立的实验模型。结果显示：实验结束时，左肺缺血再灌注损伤组(B组)与单纯开胸组(A组)比较，B组肺组织结构破坏及损伤程度比A组严重，犬肺功能降低，说明CPB导致了犬肺组织损伤，模型成功建立。

目前多数研究认为，体外循环诱发的全身性炎症反应及肺缺血再灌注损伤是CPB肺损伤的主要原因。CPB后血液与人工材料表面的直接接触、手术自身创伤、体温变化、肝素及鱼精蛋白的使用等均可产生全身性炎症反应，肺组织内皮细胞损伤，破坏肺组织结构，影响术后肺功能[5]。当心脏复跳、腔静脉开放后，肺循环重新开放，大量高氧合血液再次进入肺循环，产生大量氧自由基直接破坏肺泡上皮细胞和内皮细胞，引起细胞过度凋亡，进一步加重CPB肺损伤[6]。

七氟醚是一种新型的卤素类吸入麻醉药，作用时间相对较短，可控性好，肌松药用量小，术后苏醒快，具有稳定血流动力学和减少麻醉药用量的特点，且呼吸抑制作用小，对器官也有保护作用，目前已广泛应用于临床。Cho等[7]研究证明，体外循环下行瓣膜置换手术的病人通过七氟醚处理，患者术后肺部炎症反应明显轻于芬太尼和舒芬太尼处理组。七氟醚预处理能够改善CPB患者的肺换气功能，并提高其肺顺应性，明显缩短患者呼吸支持时间[8]。同时临床研究发现七氟烷可改善心肺转流冠状动脉旁路移植术患者肺功能指标，可选择性的抑制中性粒细胞的活性，降低肺泡毛细血管的通透性，减轻肺损伤[9]。七氟醚抑制单核巨噬细胞释放TNF-α，可减轻肺组织炎症反应及细胞过度凋亡，对肺损伤有一定保护作用[10]。本实验结果显示：在CPB后开放肺动脉时，经人工膜肺进行七氟醚后处理30 min发现，与B组相比，C组肺功能得到明显改善，肺组织病理改变减轻，说明七氟醚后处理可改善肺功能，减轻CPB肺损伤。

TNF- α是一个强有力的炎症介质，是炎性细胞因子网络中的关键成分。主要由肺泡单核巨噬细胞产生，它协同激活核因子-KB(NF-KB)产生细胞因子，启动炎症级联反应，诱导多形核粒细胞(PMNs)迁移和聚集，不仅启动早期炎症反应而且维持炎症[11]。TNF-α在肺组织表达水平的高低，影响着CPB后肺部炎症的发生发展及肺泡活性因子的含量，决定着肺组织损伤程度[12]。CPB后血液与管道接触可直接刺激白细胞生成和聚集，使白细胞表面TNF- α基因表达增加；同时主动脉开放后，缺血器官再灌注进一步导致补体激活，尤其是 C5a 可以诱导白细胞聚集产生TNF- α[13]。临床研究表明，CPB过程中，各种炎性因子(如IL-1、IL-6等)的活化都远远滞后于TNF-α的激活，TNF-α是各种炎症因子发生激活的触发点，在CPB导致肺损伤的炎性过程中起着重要作用[2]。通过用肿瘤坏死因子-α抗体进行干预能减轻CPB肺损伤[14]。本研究结果：随CPB时间的延长，肺组织结构紊乱，肺泡壁断裂严重，肺泡腔塌陷充满水肿液，B组RI明显升高，而OI则显著降低；同时B组肺组织TNF-α的含量明显增加；说明CPB导致的肺损伤可能与肺组织TNF-α的含量增加有关。通过七氟醚后处理，C组犬肺功能明显改善，肺组织病理改变明显比B组轻，同时肺组织TNF-α的含量低于B组(P<0.05)，说明七氟醚后处理可降低肺组织TNF-α含量，减轻CPB肺损伤。

本实验表明：CPB导致的肺损伤可能与肺组织TNF-α增加有关。七氟醚后处理可抑制TNF-α的产生，减轻CPB犬肺损伤。但TNF-α在CPB肺损伤是否占主导地位仍有待进一步研究。

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收稿2015-10-20;修回2015-11-12]

(编辑：王静)

The role of tumor necrosis factor-α in sevoflurane postconditioning alleviating cardiopulmonary bypass related lung injury in dogs

XieFei1,LiDongdong2,LuoJunli3,HeMiao1,ZhangHong1

(1.Guizhou Graduate Education Innovation Base of Anesthesiology, Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Yidu Central Hospital, Weifang Shandong 261000, China; 3.The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the effect of sevoflurane postconditioning on expression of TNF-α in lungs of dogs during cardiopulmonary bypass (CPB) and explore mechanisms of sevoflurane postconditioning alleviating CPB-induced lung injury.Methods Eighteen healthy dogs were randomly divided into 3 groups (n=6 each): simple operation group (group A), left lung ischemia-reperfusion injury of CPB group (group B), sevoflurane postconditioning group (group C). All dogs received intraperitoneal injection of 2.5% sodium pentobarbital and double lumen bronchial tube intubation. After cutting the sternum，the left pulmonary artery was separated and blocked to establish lung ischemia reperfusion injury model in B and C group. In C group, 2% sevoflurane was administrated for 30 minutes at the onset of opening left pulmonary artery. In A group, sternotomy was completed without other treatments. Arterial blood was collected before CPB (T1), at the onset of opening artery (T2) and 2 h after CPB (T3) to calculate oxygenation index (OI) and respiration index (RI). Left lung tissues were taken to measure following indexes. Hematoxylin-eosin staining was performed to observe the pathological changes. The expression of TNF-α was measured with enzyme linked immunosorbent assay method (ELISA).Results (1) The changes of lung function index: In A group, there was no significant difference among three time points (P>0.05); The value of OI was gradually decreased at T1~T3in B and C group (P>0.05), while RI showed a contrary trend obviously (P<0.05). There were no obvious changes of OI and RI in every group at T1time (P>0.05). The value of OI in the group B and C were obviously lower than that of group A at T2and T3time, while RI showed a contrary trend (P<0.05). C groups’ OI values were obviously higher than group B (P<0.05), and RI values were obviously lower than group B (P<0.05). (2) Pathological changes under optical microscope: The damage of lung tissue was gradually aggravated at T1~T3in all groups. At T3, the injury of lung tissue in A group was lower than that in B and C group, while the C group was significantly lower than the B group. (3) The expression changes of TNF-α: There were no changes at any time in group A (P>0.05). The changes of TNF-α was gradually decreased at T1~T3in B and C group (P<0.05). The changes at the same time in the three groups: There were no obviously difference in every group at T1time (P>0.05). The expression in the B and C group was obviously higher than that in group A at T2、T3time (P<0.05), while the C group was significantly lower than the B group (P<0.05).Conclusion With the increase of TNF-α during CPB, the damage of lung tissue was severe and the lung function reduced, It indicates that the content of TNF-α could lead to lung injury. During CPB, sevoflurane postconditioning exerts protective effects on the lung indicated by improved lung function, alleviated pulmonary damage. The protective effect of sevoflurane postconditioning against lung injury caused by CPB is related with inhibition of TNF-α.

[Key words]TNF-α; sevoflurane postconditioning; cardiopulmonary bypass; lung injury

[中图法分类号]R332

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0576-05

[通信作者]张红，女，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：体外循环，E-mail:hianzhang@tom.com。

[基金项目]贵州科技厅联合基金资助项目(NO: 黔科合J字LKZ[2012]05)。