人大肠癌移植瘤裸小鼠的不同组织中细胞凋亡相关因子的表达差异

朱琰　刘静　范佳玮　吕祥

(1. 上海中医药大学附属曙光医院，上海　200021；2. 上海中医药大学附属市中医医院，上海　200071)



·论著·

人大肠癌移植瘤裸小鼠的不同组织中细胞凋亡相关因子的表达差异

朱琰1刘静2范佳玮2吕祥2

(1. 上海中医药大学附属曙光医院，上海200021；2. 上海中医药大学附属市中医医院，上海200071)

摘要目的：研究人大肠癌移植瘤裸小鼠的肿瘤组织、肿瘤邻近正常肠组织和远端正常肠组织中细胞凋亡相关因子的表达差异。方法： 用12只BALB/C裸小鼠建立人大肠癌原位移植瘤模型，于接种后8周处死。采用RT-PCR和免疫组化法检测肿瘤组织、肿瘤邻近(距肿瘤切缘1 cm)正常肠组织和远端(距肿瘤切缘>3 cm)正常肠组织中信号转导子与激活子3(STAT3)、Bcl-2、Survivin、caspase-9、caspase-8和caspase-3等与细胞凋亡相关的因子的表达水平。结果：RT-PCR和免疫组化结果显示，肿瘤组织中STAT3、Survivin的mRNA表达水平以及STAT3、Bcl-2、Survivin的蛋白表达水平均高于肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织，肿瘤组织中caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表达水平均低于肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织，差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤邻近正常肠组织中STAT3的蛋白表达水平和Bcl-2的mRNA表达水平均高于远端正常肠组织，差异有统计学意义(P<0.05)，其他基因在肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织中的表达水平差异无统计学意义。肿瘤邻近正常肠组织与肿瘤组织中Bcl-2的表达水平差异无统计学意义。结论：人大肠癌移植瘤组织中的细胞凋亡情况明显异于正常组织。肿瘤邻近正常肠组织中STAT3和Bcl-2的表达水平高于远端正常肠组织，这可能是引起肿瘤复发转移的原因之一，尚需进一步研究证实。

关键词大肠癌；细胞凋亡；信号转导子与激活子3；Bcl-2

细胞凋亡对维持机体内环境的稳定及维持正常细胞的形态结构至关重要[1]。在肿瘤的发生发展过程中, 细胞凋亡也扮演了重要角色[2]。目前已发现，大肠癌的发生发展与多种凋亡相关因子有密切关系，这些因子既可能独立发挥作用，也可能通过相互影响，最终形成影响细胞凋亡的网络[3-4]。本研究通过构建人大肠癌移植瘤裸小鼠模型，观察肿瘤组织、肿瘤邻近正常肠组织和远端正常肠组织中细胞凋亡因子的表达情况。

1资料与方法

1.1实验动物BALB/C裸小鼠13只，SPF级，4~6周龄，体质量18~20 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，在上海中医药大学动物实验室(许可证号：SYXK[沪]2004-2005)按SPF级要求饲养，自由饮食。

1.2造模方法

1.2.1裸小鼠原位移植瘤块的制备取BALB/C裸小鼠1只，将对数生长期的大肠癌HT-29细胞(由上海市肿瘤研究所提供)制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至8×107/mL，用一次性无菌注射器在裸小鼠右侧腋下行皮下注射，每只裸小鼠剂量为0.1 mL。连续观察4周，当皮下瘤直径达1 cm时处死裸小鼠，切下瘤块，去除坏死部分，切取淡黄色或呈鱼肉状的瘤组织并置于0.9%氯化钠液中，剪成直径2 mm的瘤块备用。

1.2.2裸小鼠原位移植瘤模型的制作12只裸小鼠术前禁食12 h，腹腔内注射氯胺酮麻醉，仰卧固定，选择下腹正中切口，打开腹腔，找到盲肠，在距离盲肠末端1 cm处肠系膜侧的浆膜面用手术刀轻轻刮伤浆膜层，然后用8-0无损伤尼龙线和圆针将已制备好的新鲜瘤块行“8”字全层透壁包埋缝合在损伤处，再用无损伤缝线全层缝合，术毕观察至无活动性出血后关腹。术后暂时分笼饲养所有裸小鼠，至完全清醒。整个手术过程在切除皮下瘤后1 h内完成。

1.3标本处理所有裸小鼠均于接种后8周处死。处死后立即打开腹腔，切取肿瘤组织，并取肿瘤邻近(距肿瘤切缘1 cm)正常肠组织和远端(距肿瘤切缘>3 cm)正常肠组织。各取小块组织立刻保存于-80℃液氮；其余经10%福尔马林溶液固定，送病理检查。

1.4指标检测

1.4.1免疫组化检测采用免疫组化法检测STAT3、Bcl-2、Survivin、caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达情况，试剂由美国Santa Cruz公司提供，检测方法详见说明书。

1.4.2RT-PCR检测对STAT3、Bcl-2和Survivin进行RT-PCR检测，组织中总RNA的抽提、逆转录方法参照试剂说明书(试剂由上海申能博彩生物技术有限公司和美国Invitrogen公司提供)。引物序列见表1，由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR扩增条件：50℃ 2 min，95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 45 s，40个循环。用RT-PCR检测仪(美国ABI公司，型号ABI-7300)的自带软件(ABI Prism 7300 SDS Software)采集和分析数据，采用公式2-ΔΔCT计算mRNA的相对表达量。

表1　凋亡相关因子的引物序列

2结果

2.1病理检查从各裸鼠获得的瘤块组织均为低至中度分化腺癌，癌细胞异型性明显，多呈实体状排列，部分呈腺样排列，肿瘤间质少，均有不同程度的肿瘤组织坏死和炎细胞浸润。对邻近正常肠组织和远端正常肠组织的病理检查均未发现肿瘤细胞。

2.2各细胞凋亡相关因子转录水平的表达情况肿瘤组织和肿瘤邻近正常肠组织中Bcl-2 的mRNA表达水平高于远端正常肠组织(P<0.05)；肿瘤邻近正常肠组织与肿瘤组织中Bcl-2 的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤组织中STAT3和Survivin的mRNA表达水平高于远端正常肠组织与肿瘤邻近正常肠组织(P<0.05)。STAT3和Survivin的的mRNA表达水平在肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3各细胞凋亡相关因子蛋白水平的表达状况检测肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织中STAT3、Bcl-2、Survivin的蛋白表达水平均低于肿瘤组织(P<0.05)。肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织中caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表达水平均高于肿瘤组织(P<0.05)。Bcl-2、Survivin、caspase-3、caspase-8和caspase-9的蛋白表达水平在肿瘤邻近正常肠组织与远端正常肠组织间的差异无统计学意义(P>0.05)。STAT3在肿瘤邻近正常肠组织中的蛋白表达水平高于远端正常肠组织(P<0.05)。见表3。

表2　各种组织中STAT3、Bcl-2、Survivin的RT-PCR检测结果

注：*与肿瘤组织比较，P<0.05；#与肿瘤邻近正常肠组织比较，P<0.05

表3　各种组织中凋亡相关因子的免疫组化检测结果

注：*与肿瘤组织比较，P<0.05；#与肿瘤邻近正常肠组织比较，P<0.05

3讨论

信号转导子与激活子家族(STAT)是公认的癌基因家族，STAT3是STAT家族的重要成员[5]。研究[6-8]证实，STAT3参与肿瘤细胞增殖、抗细胞凋亡和肿瘤血管生成等多种致癌途径，在多发性骨髓瘤、肠癌、肺癌以及头颈部肿瘤等多种肿瘤中均发现STAT3过表达，且其表达水平与肿瘤的恶性程度及预后密切相关。在大肠癌的研究[9]中发现，STAT3蛋白不仅在肿瘤组织中过表达，而且与肿瘤的复发转移以及Duke’s分期有关；提示STAT3在大肠癌发生发展中有重要作用，阻断STAT3信号转导通路可能对治疗大肠癌有效。Bcl-2和Survivin均为STAT3下游的因子，两者均可调控天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)家族。Survivin可通过内源性及外源性途径最终作用于caspase家族，抑制细胞凋亡[10]。研究[11-13]表明，大肠癌中Survivin呈高表达或过表达，且其与大肠癌分期及远处转移有关。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的关键调节因子，其表达的改变不仅影响DNA损伤细胞或周期异常细胞的正常凋亡，还影响肿瘤细胞的凋亡[14]。Bcl-2可通过阻断细胞色素c从线粒体释放而影响caspase家族，抑制细胞凋亡。caspase家族结构中含有半胱氨酸，可分为起始caspase和执行caspase，其中caspase-8和caspase-9参与细胞凋亡的起始，caspase-7参与细胞凋亡的执行。在凋亡信号的作用下，细胞色素c从线粒体释放出来，使caspase-9前体转变成caspase-9，后者再激活caspase-3，激活的caspase-3引起DNA断裂和细胞骨架成分降解。

在本研究中，我们通过RT-PCR和免疫组化分析了人大肠癌移植瘤裸小鼠的肿瘤组织、肿瘤近端正常肠组织以及远端正常肠组织中的细胞凋亡相关因子(STAT3、Bcl-2、Survivin、caspase-3、caspase-8和caspase-9)的表达情况。结果显示，几乎上述所有的细胞凋亡相关因子在肿瘤组织中都有异常表达，显示为STAT3、Bcl-2和Survivin的高表达以及caspase-3、caspase-8和caspase-9的低表达。STAT3和Bcl-2在肿瘤邻近组织中的表达高于远端正常肠组织。STAT3和Bcl-2是细胞凋亡相关因子中较为上游的因子。本研究发现，即使肿瘤邻近组织的病理学检查结果正常，其也可能有较早期的细胞凋亡异常，这是值得关注的。此外，研究[15]显示，STAT3等因子也与肿瘤血管生成相关，在大肠癌中STAT3表达与血管表皮生长因子(VEGF)表达均升高，并呈正相关；我们以往的研究也显示，肿瘤邻近正常肠组织的血管生成异常活跃，表现为VEGF、环氧化酶-2(COX-2)高表达和微血管密度增高[16]。结合以往的研究结果，肿瘤邻近正常肠组织可能存在细胞凋亡和肿瘤血管生成的异常表现，这些因素可能与大肠癌复发转移相关。

参考文献

[1]Lev-Ari S, Starr A, Katzburg S, et al. Curcumin induces apoptosis and inhibits growth of orthotopic human non-small cell lung cancer xenografts[J]. J Nutr Biochem,2014, 25(5): 843-850.

[2]Kim JH, Yoon EK, Chung HJ, et al. p53 acetylation enhances Taxol-induced apoptosis in human cancer cells[J]. Apoptosis,2013, 18(3): 110-120.

[3]Valeri N, Braconi C, Gasparini P, et al. MicroRNA-135b promotes cancer progression by acting as a downstream effector of oncogenic pathways in colon cancer[J]. Cancer Cell,2014, 25(4):469-483.

[4]Chen L, Fu L, Kong X, et al. Jumonji domain-containing protein 2B silencing induces DNA damage response via STAT3 pathway in colorectal cancer[J]. Br J Cancer,2014, 110(4):1014-1026.

[5]赵美，姜斌． 靶向STAT3 的核酸类抑制剂治疗肿瘤的研究进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，2011,18(2):230-234.

[6]Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al. Stat3 as an oncogene[J]. Cell, 1999, 98(3): 295-303.

[7]Bromberg J. Stat proteins and oncogenesis[J]. J Clin Invest, 2002, 109(9): 1139-1142.

[8]张国强，曹立宇. STAT3在大肠癌中的表达及其临床意义[J]. 安徽医药，2012, 26(10): 1442-1443.

[9]O′Sullivan KE, Reynolds JV, O′Hanlon C, et al. Could signal transducer and activator of transcription 3 be a therapeutic target in obesity-related gastrointestinal malignancy? [J]. J Gastrointest Cancer, 2014, 45(1):1-11.

[10]Altieri DC．Validating surviving as a cancer therapeutic target[J]．Nat Rev Cancer, 2003, 3(1): 46-54.

[11]Chandele A，Prasad V，Jagtap JC，et al．Upregulation of survivin in G2/M cells and inhibition of caspese 9 activity enhances resistance in staurosporine-induced apoptosis[J]．Neoplasia, 2004, 6(1): 29-40.

[12]Sarela AI，Macadam RC，Farmery SM，et a1．Expression of the antiapoptosis gene surviving predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J]．Gut, 2000, 46(5): 645-650.

[13]张卫国，吴清明，王小虎，等．Survivin基因在大肠癌中的表达与生物学特性的关系[J]．胃肠病学和肝病学杂志，2003, 12(6): 547-548.[14] 金军，袁宏银，熊金．bag-1、bcl-2在大肠腺瘤和大肠癌中的表达及意义[J]．肿瘤防治研究，2005, 32(5): 284-286.

[15]陆娜娜，尹玉，李昊，等. 大肠癌中STAT3和VEGF的表达及相关性研究[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2012, 21(2): 122-125.

[16]朱琰，刘静，史勤，等. 人大肠癌移植瘤裸小鼠不同组织中血管生成相关因子的差异[J]. 实用临床医药杂志，2012,16(11): 1-3.

The Differences Regarding Expression of Apoptosis Related Factors among Different Tissues of Nude Mice with Transplanted Human Colorectal Cancer

ZHUYan1LIUJing2FANJiawei2LVXiang21.ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China; 2.MunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China

AbstractObjective：To investigate the differences regarding expression of apoptosis related factors among tumor tissue, adjacent normal bowel tissue, and distal normal bowel tissue of nude mice with transplanted human colorectal cancer. Methods:Orthotopic tumor models of transplanted human colorectal cancer were established in 12 BALB/C nude mice, and the mice were killed eight weeks after transplantation. The expression levels of apoptosis related factors such as signal transducer and activator of transcription 3(STAT3), Bcl-2, Survivin, caspase-9, caspase-8 and caspase-3, in tumor tissues, adjacent (1 cm distance from tumor tissue) normal bowel tissues, and distal (>5 cm distance from tumor tissue) normal bowel tissues, were assessed by RT-PCR and immunohistochemistry assay. Results: The mRNA expression of STAT3 and Survivin, as well as the protein expression of STAT3, Bcl-2 and Survivin in tumor tissue were higher than those in adjacent normal bowel tissue and distal normal bowel tissue, as results of RT-PCR and immunohistochemistry assay showed, while the protein expression of caspase-8, caspase-9 and caspase-3 in tumor tissue were lower than those in adjacent normal bowel tissue and distal normal bowel tissue. And all the differences were statistically significant(allP<0.05). The protein expression of STAT3 and the mRNA expression of Bcl-2 in adjacent normal bowel tissue were higher than those in distal normal bowel tissue. Both the differences were statistically significant(bothP<0.05). The other genes showed no statistically significant difference between adjacent normal bowel tissue and distal normal bowel tissue regarding expression level. There was no statistically significant difference regarding Bcl-2 expression between tumor tissue and adjacent normal bowel tissue. Conclusions: The apoptosis status in tissue of transplanted human colorectal cancer was significantly different from that in normal tissue. The expression levels of STAT3 and Bcl-2 in adjacent normal bowel tissue were higher than those in distal normal bowel tissue. This may be one of the reasons for tumor recurrence and metastasis. However, further researches are needed for confirmation.

Key WordsColorectal cancer;Apoptosis;Signal transducer and activator of transcription 3;Bcl-2

通讯作者刘静，E-mail：wildroselj@hotmail.com

基金项目：上海市中西医结合学会科研基金项目(编号：zxyQ-1226)；上海市自然科学基金项目(编号：08ZR1419300)；上海市教委科研创新项目(编号：08YZ59)

中图分类号R 735.3

文献标识码A