上海青浦地区结核分枝杆菌基因分型及其人群分布特点

彭荣　费凤英　张斌

(复旦大学附属中山医院青浦分院　a检验科，b感染科，上海　201700)



·论著·

上海青浦地区结核分枝杆菌基因分型及其人群分布特点

彭荣a费凤英a张斌b

(复旦大学附属中山医院青浦分院a检验科，b感染科，上海201700)

摘要目的：探讨上海市青浦区结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)的主要分型及其人群分布特点。方法： 收集2011年12月—2013年12月上海中山医院青浦分院分离培养的266株M.tb，分别提取M.tb基因组，应用多重PCR法鉴定北京基因型和非北京基因型，并分析两种分型在本地区不同性别、年龄及户籍患者中的分布差异。结果：266株M.tb中，北京基因型菌株242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)，差异有显著统计学意义(χ2=357.32，P<0.01)。进一步研究发现，北京基因型菌株与非北京基因型菌株在不同性别(χ2=0.071，P>0.05)、不同年龄(χ2=0.152，P>0.05)及不同户籍(χ2=0.053，P>0.05)的人群分布的差异无统计学意义。结论：北京基因型菌株可能是上海市青浦区M.tb的主要流行株，但其分布与性别、年龄及户籍的关系不明显。

关键词结核分枝杆菌；基因分型；北京基因型；人群分布

上世纪末，随着基因研究的深入，人们对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)有了较深的认识。1995年Van Soolingen等[1]在中国及周边国家发现了M.tb北京基因型家族，该家族具有相同的IS6110基因标记特征。目前，北京基因型M.tb已在全球传播，有研究[2]表明其分布约占全球已分离M.tb菌株的13%。北京基因型M.tb作为世界范围内的第二大流行结核杆菌，具有毒力高、传播能力强、易突变等特点，能够逃脱卡介苗的免疫保护，并易产生耐药甚至耐多药 (multidrug-resistant，MDR)[3]。国内有学者分别研究了天津[4]、浙江[5]等区域M.tb的基因分型，结果表明北京基因型菌株在这些区域占主导地位，但流行特征不尽相同。为进一步做好上海市青浦区的结核防治工作，本研究分析了2011年12月—2013年12月复旦大学附属中山医院青浦分院分离培养的266株M.tb的基因分型，并比较了不同基因型的性别、年龄及户籍分布差异。

1资料与方法

1.1菌株来源从复旦大学附属中山医院青浦分院(该院是上海市青浦区唯一的结核病定点医院，收治了该地区大多数的肺结核病患者) 2011年12月—2013年12月收治的肺结核患者(排除非M.tb感染者及携带多菌种的患者)痰标本中初次分离出培养的266株M.tb，并收集菌株对应患者的性别、年龄以及户籍信息。H37Rv标准菌株由同济大学附属上海市肺科医院检验科惠赠。

1.2主要试剂与仪器罗氏培养基购自上海疾控生物科技有限公司；PCR仪、电泳仪及电泳槽购自美国Bio-Rad公司；快速细菌基因提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；引物及Marker由上海剑钝生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1基因组提取将菌株转种于中性罗氏培养基，37℃孵育4周，待长出后，取菌落，用500 μL含有吐温-80的磷酸盐溶液(PBS，pH7.8)充分分散，经80℃水浴2 h灭活后，用快速细菌基因提取试剂盒(Cat:N1152)提取基因组。

1.3.2基因型的鉴定采用经改进的多重PCR方法及琼脂糖凝胶电泳[6-7]鉴定北京及非北京基因型M.tb。北京基因型菌株上游引物为5′-ACAGGAAGCCGAATGAGGAC-3′，下游引物为5′-CGAAGGAGACCTCGTAGACAAG-3′ (GenBank AF390039)；非北京型基因型菌株上游引物为5′-TGGGTCTGACGACTTGAACAC-3′，下游引物为5′-ACCTTCAGCACCACCATCATC -3′ (GenBank BX842581)。北京基因型和非北京型基因型的目的扩增片段长度分别为261 bp和491 bp。PCR体系的建立：采用15μL体系，引物终浓度为0.2 μmol/L，DNA模板为10～20 ng，2×Master Mix 7.5 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72℃延伸5 min。多重PCR方法的建立[6]：将H37Rv标准株、已确定的北京型基因M.tb和本研究临床分离的菌株基因组作为模板，用北京及非北京基因型混合引物进行多重PCR扩增。每次试验均设置无模板对照组。琼脂糖凝胶电泳：PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶(含4 μL/80 mL的溴化乙锭DNA染料)恒电压(5V/1cm)电泳，将100 bp DNA leader 作为分子量标志物。应用Bio-Rad凝胶成像系统分析目的基因片段。

1.3.3统计学处理所有数据经SPSS 17.0软件统计分析。计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1基因型鉴定266株M.tb中，北京基因型242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)，差异有显著统计学意义(χ2=357.32，P<0.01)。见图1。

图1　多重PCR鉴定M.tb的琼脂糖电泳结果

M：DNA标志物；1：H37Rv标准株扩增条带491 bp；2：已知北京基因型菌株扩增条带约261 bp； 3~24泳道为临床分离株扩增条带(3，6，9，12，13，14，18泳道为非北京基因型菌株；4，5，7，8，10，11，15~17，19~24泳道为北京基因型菌株)。

2.2两种基因型M.tb的性别、年龄、户籍分布266株M.tb中，北京基因型和非北京基因型M.tb在不同性别(χ2=0.071，P>0.05)、不同年龄(χ2=0.152，P>0.05)及不同户籍(χ2=0.053，P>0.05)人群中的分布差异无统计学意义。见表1。

表1　上海市青浦区两种基因型M.tb人群分布的基本特征(n,%)

3讨论

本研究根据北京基因型菌株基因组中Rv2816和Rv2819序列缺失的特点，采用改进的多重PCR反应鉴定了北京基因型和非北京基因型M.tb，该方法与间隔区寡聚核苷酸分型法(spoligotyping)的鉴定结果一致率为100%[6-7]，而且较spoligotyping分型法简单易行、经济实用，因而值得在临床推广应用。

尽管国内北京基因型M.tb流行已近半个世纪，但对其流行病学特点还不十分清楚。北京基因型M.tb在世界各地均有发现，但有明显的地域差异，其中在亚洲达50%左右，而在中国比例更高，达86%[1]。本研究对上海市青浦地区266株M.tb进行了基因分型，发现北京基因型菌株242株(242/266，90.98%)，非北京基因型24株(24/266，9.02%)，差异有显著统计学意义(χ2=357.32，P<0.01)，表明北京基因型菌株可能是上海市青浦区M.tb的主要流行株。

目前，许多学者对不同地区M.tb不同基因型在人群中的分布特点进行了研究。其中有学者[8]对新疆地区M.tb不同基因型的分布进行了研究，发现北京基因型占43.7%，在维吾尔族和汉族病例中分别占39.5%和72.4%，有明显的种族差异。也有学者[4]对天津地区的M.tb进行了研究，发现北京基因型和非北京基因型M.tb的性别、年龄分布差异无统计学意义，但户籍差异有统计学意义。本研究显示，北京基因型菌株与非北京基因型菌株在不同性别(χ2=0.071，P>0.05)、不同年龄(χ2=0.152，P>0.05)及不同户籍(χ2=0.053，P>0.05)人群中的分布差异无统计学意义。分析认为，北京基因型M.tb的分布在不同区域及不同人群的研究结果不尽相同，可能是由于其本身亦存在亚型有关，因此有必要对其亚型分布规律做深入研究。

参考文献

[1]van Soolingen D, Qian L, de Haas P E, et al. Predominance of a single genotype of Mycobacter ium tuberculosis in countries of East Asia[J]. J Clin Microbiol. 1995, 33: 3234 -3238.

[2]Brudey K, Driscoll J R, Rigouts L, et al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping data base ( SpolD B4) for classification , population genetics and epidemiology[J] . BMC Microbiol, 2006, 6: 1 -17.

[3]Drobniewski F, Balabanova Y, Nikolayevsky V, et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia[J]. JAMA, 2005, 293 (22):2726-2731.

[4]巨韩芳，王撷秀，李桂莲，等. 天津市北京基因型结核分枝杆菌流行特征及与耐药表型关系研究[J]. 中华流行病学杂志，2011，32(2)：116-119.

[5]马慧,胡屹,蒋伟，等.中国东部农村地区结核分枝杆菌北京基因型菌株的成簇性及耐药特征研究[J]. 中华结核和呼吸杂志，2011，34(6)：447-450.

[6]赵德福, 谢彤, 巨韩芳, 等. 利用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株[J].中国防痨杂志, 2010, 32(6):315-317.

[7]Hillemann D，Warren R，Kubica T．et al．Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains by real-time PCR[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44 (2):302-306.

[8]吴长东，米利古，龚天美，等.RD105缺失基因检测法用于结核分枝杆菌新疆“北京家族”临床分离株的鉴定[J].中国病原微生物杂志，2010,5(3)：161-167.

The Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis and Its Characteristics of Population Distribution in Qingpu District of Shanghai City

PENGRongaFEIFengyinaZHANGBinbaLaboratoryDepartment,bInfectionsDepartment,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China

AbstractObjective：To explore the predominant genotyping ofMycobacteriumtuberculosis(M.tb)and its population distribution in Qingpu District of Shanghai City. Methods:A total of 266 M.tb isolates were collected from Qingpu Branch of Zhongshan Hospital from December 2011 to December 2013, of which the genomes were extracted. Bejing genotype and non-Bejing genotype were identified by multiplex polymerase chain reaction(PCR), and the differences regarding distributions in gender, age, and domicile population between the two genotypes were analyzed. Results: Among the 266 M.tb isolates, there were 242 strains(90.98%) of Bejing genotype and 24 strains(9.02%) of non- Bejing genotype，and the difference was statistically significant (χ2=357.32，P<0.01). But there was no significant difference between Bejing genotype and non-Bejing genotype regarding population distribution in different gender (χ2=0.071，P>0.05)， age(χ2=0.152，P>0.05)and domicile (χ2=0.053，P>0.05). Conclusions: The main popular strain of M.tb in Qingpu District of Shanghai City may be Bejing genotype, but its distribution was not significantly related with gender, age and domicile.

Key WordsMycobacteriumtuberculosis;Genotyping;Beijing genotype;Population distribution

通讯作者张斌，Email：zhxy2010@163.com

基金项目：复旦大学附属中山医院青浦分院课题(编号：2013K05)

中图分类号R 378.91+1

文献标识码A