小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤不同时间点基因表达谱的差异

黄凝　仓静　薛张纲　王浩

(复旦大学附属中山医院麻醉科，上海　200032)



·论著·

小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤不同时间点基因表达谱的差异

黄凝仓静薛张纲王浩

(复旦大学附属中山医院麻醉科，上海200032)

摘要目的：探讨小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤不同时间点基因表达谱的差异。方法： 建立小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤模型，收集再灌注4 h与24 h时缺血侧与对照侧肾脏组织标本，采用基因表达谱芯片技术检测各组标本的基因表达水平，再结合生物信息学技术分析差异表达的基因种类(gene ontology，GO)与信号通路，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法验证表达上调、下调与未变化的基因。结果：小鼠肾脏急性缺血再灌注24 h差异表达的基因数目多于再灌注4 h；再灌注4 h时的变化基因主要为代谢与应激相关类型，24 h时的变化基因涉及炎性反应与细胞凋亡等；再灌注4 h和24 h时，缺血再灌注引起的表达上调的基因数目均多于表达下调的基因数目；随机挑选的表达上调、下调与未变化基因可以被实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法验证。结论：缺血再灌注损伤伴随着大量基因表达的改变，缺血再灌注损伤不同时期的差异表达基因与病理生理变化密切相关。

关键词缺血再灌注；基因表达；小鼠肾脏

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)引起的组织损伤参与了包括心肌梗死、缺血性中风、急性肾损伤、外伤、镰状红细胞性贫血和睡眠呼吸暂停等多种病理过程，可引起多种疾病甚至导致死亡[1]。在外科手术中，IR损伤也是器官移植、心胸外科、大血管等手术过程中不容忽视的问题。

IR损伤是器官血供受限使组织灌注不足并持续一段时间后重新恢复灌注和氧供的过程。缺血期间器官能量供应和需求间的不平衡直接造成组织缺氧和微循环功能紊乱；而随后的再灌注过程则会引起固有和获得性免疫应答，并激活细胞死亡相关程序。因此IR损伤是多种细胞损伤机制相互作用的结果[2]。尽管缺血波及的范围(全身性或区域性)、类型(热缺血或冷缺血)及受损器官不同时，IR的形成机制间存在诸多差异，但仍有共同之处。在缺血期血管内皮细胞屏障功能会因缺氧而导致受损，引起血管通透性增加和漏出物增多。再灌注期重新恢复血供后，缺血器官并不可能立即恢复正常灌注(无复流现象)，缺血期微循环内堆积的各种受损细胞组分会作为自身抗原激活抗体识别系统并活化补体系统[1]。尽管IR是在无菌环境内发生，但仍然伴有固有和获得性免疫应答过程，并且活化的免疫系统会通过激活模式识别受体，输送大量炎性细胞至受损器官参与损伤的形成[3]。此外，缺血及再灌注都可引起细胞凋亡、坏死和自噬相关性细胞死亡等多种形式的细胞死亡[4]。

广泛的基因表达变化也是IR损伤的一大特征。应用基因表达谱芯片或RNA-seq技术进行的多项研究[5-8]发现，IR伴随大量基因转录水平的改变：脑组织IR过程中促炎因子、转录因子和抗氧化酶等基因的mRNA增加，而离子通道、蛋白激酶等相关基因的mRNA减少；肾脏IR后促凋亡基因、转录因子和信号转导分子表达明显增加，而细胞能量及生物合成相关酶的表达明显降低。这些研究结果均表明IR伴有明显的转录重编程过程。IR损伤过程中基因转录变化的调控机制也被广泛研究。脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)对缺氧和炎性信号通路有重要影响，PHD的催化作用需要氧气作为辅因子，因而对缺血缺氧尤为敏感。缺血期PHD的活性受抑制会增强缺氧诱导因子和核因子κB的稳定性[9]。由于这2种转录因子参与了多种基因的转录调控，可引起广泛的基因转录改变。近年来基因表达谱芯片与二代测序技术的快速发展，为全面阐明这种广泛的基因转录变化机制提供了契机。

IR过程伴随的基因转录变化对基因的损伤与修复发挥重要作用。因此，本研究采用基因表达谱芯片技术检测小鼠肾脏IR后4 h与24 h的基因表达变化，分析早期和中期的基因表达差异，试图为肾脏急性IR损伤的分子机制研究提供新线索。

1资料与方法

1.1小鼠肾脏急性IR损伤模型的建立选择SPF级、4～6周龄、C57BL/6雄性小鼠，体质量为18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，操作均遵守复旦大学附属中山医院实验动物伦理管理委员会关于动物实验的相关规定。选取20只小鼠以左侧肾脏建立肾脏IR模型，右侧肾脏接受假手术作为正常对照。同时将小鼠随机分为2组，各10只，分别再灌注4 h和24 h后处死。所有小鼠均于标准实验条件适应性饲养1周。腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(70 mg/kg)实施麻醉。待钳夹鼠尾无体动反应后，将小鼠侧卧位放置于恒温灯照射的手术平台上，消毒备皮后，经侧腹部切口分别暴露双侧肾脏并将肾脏游离至切口外，以温热0.9%氯化钠液浸润的无菌纱布保护肾脏。分离出左侧肾蒂，同时注意保护输尿管，除去肾周筋膜后，以无损伤动脉夹夹闭肾蒂，通过观察肾脏颜色变化确认是否实现肾脏缺血。缺血40 min后松开动脉夹，观察肾脏颜色恢复鲜红则确认再灌注成功。术中注意维持小鼠气道通畅，并注意观察小鼠呼吸频率及趾端颜色，维持体温于36～38 ℃，同时以0.9%氯化钠液浸润的无菌纱布保护切口及游离肾脏，减少液体丢失。手术结束后，回纳肾脏并分层缝合切口。所有小鼠术后均存活。于再灌注4 h、24 h后脱颈处死动物，用0.9%氯化钠液洗去血污，将肾脏组织即刻冻存于液氮或以4%甲醛溶液固定。IR侧与对照侧肾脏的组织切片与HE染色按常规病理切片染色操作进行。

1.2小鼠肾脏RNA抽提和纯化采用德国Qiagen公司的RNeasy Mini Kit抽提小鼠肾脏组织的总RNA，采用Nanodrop测定RNA浓度。

1.3小鼠肾脏基因表达谱芯片分析RNA样品由上海其明信息技术有限公司进行进一步处理后采用Affymetrix Mouse Gene 1.0芯片进行基因表达谱芯片检测。芯片数据经过标化处理后得到各组的差异基因。对这些基因进行基因种类(gene ontology，GO)与信号通路分析。

1.4实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain，RT-qPCR)采用日本Takara公司试剂盒进行RT-qPCR检测，使用美国Bio-Rad公司PCR仪。引物序列：内参照甘油醛-3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物：5′-GTGTTCCTACCCCCAATGTGT-3′，GAPDH 下游引物：5′-ATTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3′；Tet1上游引物：5′-CGAAAGAACAGCCACCAGAT-3′，Tet1下游引物：5′-TTGCTCTTCTTCCCCATGAC-3′；Tet2上游引物：5′-GTTGCAAGAAGAAAGCGGAG-3′，Tet2下游引物：5′-CTCTGCCCTTGCTGAAGGT-3′；Pank1上游引物：5′-CCGTACCCTATGTTGCTGGT-3′，Pank1下游引物：5′-GCCATGTCCAGAGCTTCTTC-3′；Arrb1上游引物：5′-CTCAAGCATGAGGACACGAA-3′，Arrb1下游引物：5′-TTAGGCTTGGGGTGCATTAG-3′；Dhcr24上游引物：5′-GTGTTGCCTGAGCTTGATGA-3′，Dhcr24下游引物：5′-TGAGTTTTCAGACGGTGTGC-3′；Cubn上游引物：5′-AGTCAGTCCTGGCTCCTTGA-3′，Cubn下游引物：5′-GTCTGGAGTGGTGGGGTAGA-3′；Cacnb2上游引物：5′-AGTCAGTCCTGGCTCCTTGA-3′，Cacnb2下游引物：5′-GTCTGGAGTGGTGGGGTAGA-3′；Ccl2上游引物：5′-AGGTCCCTGTCATGCTTCTG-3′， Ccl2下游引物：5′-TCTGGACCCATTCCTTCTTG-3′；Tgfrsf1a上游引物：5′-CAGTCTGCAGGGAGTGTGAA-3′; Tgfrsf1a下游引物：5′-CACGCACTGGAAGTGTGTCT-3′；Bdh1上游引物：5′-CGGCTAGTGGCAAAGCTATC-3′，Bdh1下游引物：5′-GTTGCAGACATTGAGCTGGA-3′；Upb1上游引物：5′-AATATGCCGTTCGCTTTTTG-3′，Upb1下游引物：5′-TCCCCCATGCTCTCTATCAC-3′；Pgam2上游引物：5′-ACACCTCCATCAGCAAGGAC-3′，Pgam2下游引物：5′-GGGCTGCAATAAGCACTCTC-3′；Idh1上游引物：5′-AGGTTCTGTGGTGGAGATGC-3′，Idh1下游引物：5′-GACGCCCACGTTGTATTTCT-3′；Oxgr1上游引物：5′-GGGAACAGAGGACACCAAGA-3′，Oxgr1下游引物：5′-GCCTCAGAAACTCTGCTGCT-3′；Atf3上游引物：5′-AGGCGGCGAGAAAGAAAT-3′，Atf3下游引物：5′-TCAATCTGGGCCTTCAGC-3′；Ngal上游引物：5′-CTGAATGGGTGGTGAGTGTG-3′， Ngal下游引物：5′-GGAGTGCTGGCCAAATAAGA-3′；Kim1上游引物：5′-AGCTCAGGGTCTCCTTCACA-3′，Kim1下游引物：5′-ACCACCCCCTTTACTTCCAC-3′；Cxcl10上游引物：5′-CCCACGTGTTGAGATCATTG-3′，Cxcl10下游引物：5′-CACTGGGTAAAGGGGAGTGA-3′；Ifngr2上游引物：5′-AGGCCCTTTCAAGAGCAACT-3′，Ifngr2下游引物：5′-CCAACGGAATCAGGATGACT-3′。

2结果

2.1小鼠肾脏IR模型建立HE染色结果显示，IR侧肾脏可见典型的IR的病理改变，表现为大量肾小管上皮细胞坏死、脱落，小管细胞的刷状边缘缺失明显，并伴有肾小管管腔的明显扩大和大量血细胞浸润；IR侧再灌注24 h肾脏的损伤比再灌注4 h更为严重。

2.2再灌注4 h和24 h时的基因表达差异分析基因表达谱芯片检测结果显示再灌注4 h肾脏(设定变化1倍作为基因差异表达阈值)有84个基因表达上调、19个基因表达下调；再灌注24 h肾脏有161个基因表达上调、68个基因表达下调。无论是再灌注4 h还是24 h，表达上调的基因数目均多于表达下调基因数目；再灌注24 h表达发生变化的基因总数目多于再灌注4 h。GO分析结果显示，再灌注4 h肾脏表达上调基因多与细胞应激急性期反应相关，下调基因与细胞代谢相关；Pathway分析结果显示MAPK信号通路明显活化，炎性反应相关信号通路激活，而能量代谢及各种生物合成相关通路受到了显著抑制。GO分析结果显示，再灌注24 h肾脏表达上调基因与炎性反应、凋亡及缺血损伤后修复过程密切相关，下调基因与细胞代谢相关，见图1A、1B；Pathway 分析结果显示，再灌注24 h以大量的炎性反应相关信号通路活化为主；能量代谢信号通路抑制进一步加剧，见图 1C、1D。

2.3再灌注4 h与24 h差异表达基因的验证RT-qPCR结果显示，随机挑选的靶基因mRNA 水平变化趋势与基因表达谱芯片数据一致，见图2。

3讨论

IR损伤过程的基因转录重编程对损伤的发生和恢复均有重要意义[10]，因此，本研究全面检测了IR损伤早期和中后期基因表达水平的差异。对再灌注后不同时间点(4 h和24 h)的差异基因分析显示，从IR损伤的早期(再灌注4 h)到相对中后期(再灌注 24 h)转录重编程波及的基因逐渐增加。受到显著影响的信号通路由应激相关信号通路变为炎性和免疫反应相关信号通路。这些变化特点和已发表的研究[8,11]结果一致，且与 IR损伤的演变过程相符。这些结果一方面验证了 IR 中广泛的基因转录变化，另一方面也从分子层面证实了动物模型的有效性。

本研究在不同时间点基因表达变化趋势上得到了不同的结果。首先，再灌注4 h或 24 h后，表达上调的基因数目都远多于表达下调基因。为了减少动物个体差异对筛选表达差异基因的影响，本研究采用同一只动物左侧肾脏接受IR处理，右侧肾脏作为对照的方法。这种方法可能带来的问题是：受到IR损伤的肾脏生成的一些炎性因子和分子信号物质可能会通过血液循环影响对照侧肾脏某些基因表达。但为避免动物个体差异可能对后续的基因组学分析带来更大的干扰，本研究后续研究仍采取自身对照的策略。其次，再灌注24 h的差异基因数目多于再灌注4 h。这个结果提示肾组织受损程度随着时间延长愈加严重，4 h受影响的基因多为立早基因，而24 h受影响的基因多为次级效应导致。这些特点都动态地反映了再灌注后细胞对损伤应答的变化，与IR损伤的发生过程非常吻合。最后，本研究基因表达谱芯片结果还鉴定出一些之前没有被报道的表观调控因子的表达变化(例如Tet1与Tet2)。

图1A和B分别为再灌注24 h后表达上调/下调基因的GO分析(图中所列为差异有统计学意义的前15位基因类别)；C和D分别为再灌注24 h后表达上调/下调基因的Pathway分析(图中所列为差异有统计学意义的前10位信号通路)

A：表达上调基因，B：表达下调基因，C：表达无明显变化基因；与对照侧比较，*P<0.05 (Oxgr1:P=0.023; Tet1:P=0.035; Atf3:P=0.002; Kim1:P=0.011; Ngal:P=0.041)

图2RT-qPCR验证再灌注4 h组 Microarray基因变化趋势

综上所述，本研究检测了急性IR损伤不同时间点小鼠肾脏基因表达谱的变化规律与差异，检出了IR损伤早期和相对中后期的应答基因。这些结果为今后进一步深入研究IR损伤的分子机制研究提供了新的线索，可能为IR损伤的防治奠定了基础。

参考文献

[1]Eltzschig HK,Eckle T.Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation[J].Nat Med,2011,17(11):1391-1401.

[2]Carden DL,Granger DN.Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury[J].J Pathol, 2000,190(3):255-266.

[3]Chen GY,Nunez G.Sterile inflammation:sensing and reacting to damage[J].Nat Rev Immunol,2010,10(12):826-837.

[4]Hotchkiss RS,Strasser A,McDunn JE,et al.Cell death[J].New Engl J Med,2009,361(16):1570-1583.

[5]Kim YD,Sohn NW,Kang C,et al.DNA array reveals altered gene expression in response to focal cerebral ischemia[J].Brain Res Bull,2002,58(5):491-498.

[6]Schmidt-Kastner R,Zhang B,Belayev L,et al.DNA microarray analysis of cortical gene expression during early recirculation after focal brain ischemia in rat[J].Brain Res Mol Brain Res,2002,108(1-2):81-93.

[7]Yoshida T,Kurella M,Beato F,et al.Monitoring changes in gene expression in renal ischemia-reperfusion in the rat[J].Kidney Int,2002,61(5):1646-1654.

[8]Supavekin S,Zhang W,Kucherlapati R,et al.Differential gene expression following early renal ischemia/reperfusion[J].Kidney Int,2003,63(5):1714-1724.

[9]Eltzschig HK,Carmeliet P.Hypoxia and inflammation[J].N Engl J Med,2011,364(7):656-665.

[10]Westberry JW,Prewitt AK,Wilson ME.Epigenetic regulation of the estrogen receptor alpha promoter in the cerebral cortex following ischemia in male and female rats[J].Neuroscience,2008,152(4):982-989.

[11]Parker MD,Chambers PA,Lodge JP,et al.Ischemia- reperfusion injury and its influence on the epigenetic modification of the donor kidney genome[J].Transplantation,2008,86(12):1818-1823.

Stage-Specific Differences in Gene Expression of Mouse Kidneys Insulted by Ischemia Reperfusion Injury

HUANGNingCANGJingXUEZhanggangWANGHaoDepartmentofAnesthesiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To analyze the stage-specific differences in gene expression of mouse kidneys insulted by ischemia reperfusion(IR) injury. Methods:Mouse kidney tissues were collected at 4 h and 24 h after IR.Total RNA of control and IR kidneys were prepared for Microarray and real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR) analysis. Results: The number of differential expressed genes(DEGs) at 24 h after IR was larger than that at 4 h.The DEGs at 4 h were associated with metabolism and stress responses,while the DEGs at 24 h were associated with inflammation and apoptosis.The numbers of up-regulated genes at both 4 h and 24 h were larger than those of down-regulated genes.Several down-regulated,up-regulated,or unchanged genes were confirmed by RT-qPCR. Conclusions: Stage-specific changes of gene expression occurres during IR injury.These DEGs at early or intermediate-late stages of IR injury are tightly associated with their stage-specific pathophysiological processes.

Key WordsIschemia reperfusion；Gene expression；Mouse kidneys

通讯作者王浩，E-mail：wang.hao2@zs-hospital.sh.cn

基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81301615)；上海市自然科学基金项目(编号：14ZR1406900)

中图分类号R363

文献标识码A