斑点热疫苗研究进展

龚文平，温博海

斑点热是由立克次体属（Rickettsia）的斑点热群立克次体（spotted fever group Rickettsiae,SFGR）引起的一类以急性发热和全身皮疹为主要特征的疾病总称。SFGR是一类全球性分布、严格血管内皮细胞寄生的革兰阴性小杆菌，是立克次体目中最大和最复杂的一群，到目前为止已经发现19种能引起人感染的SFGR（表1）。其中立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）在立克次体中毒性最强，其所致的落基山斑点热（Rocky Mountain spotted fever,RMSF）在无抗生素时代病死率高达60%～80%，即便在抗生素治疗（立克次体对四环素类抗生素敏感）的情况下病死率仍为5%～10%[1-2]。因此，立氏立克次体被联合国列入生物战剂和生物恐怖剂清单[3]。

斑点热主要通过蜱叮咬传播，潜伏期2～14 d。不同SFGR引起的感染有不同的病名，但临床症状大致相同，主要表现为头痛、发热、疲倦和肌肉酸痛，伴随着由四肢向躯干方向发展的皮疹[4]。立克次体感染引起内皮细胞损伤，引发局部和全身血管损伤，随着病情发展，患者可因低血压休克、急性肾衰竭、肺水肿和脑膜炎等严重并发症而死亡[5]。

斑点热早期缺乏特异性临床症状，难以确诊，患者往往因被误诊不能得到及时治疗而死亡。预防斑点热，尤其是立氏立克次体自然感染或人为攻击，迫切需要安全、有效、不良反应少的疫苗[3]。本文就疫苗的研究进展及未来发展方向进行综述。

1 灭活疫苗

和大多数疫苗的发展历程相同，斑点热疫苗研究的起点是灭活疫苗，根据技术和方法的不同又分为3个阶段。1925年，Spencer和Parker首先进行灭活立氏立克次体的RMSF疫苗研究[3]。他们首先将处于饥饿状态的蜱放在立氏立克次体感染的豚鼠身上吸血，使立克次体在蜱体内大量繁殖，随后将繁殖的立克次体从蜱体粗分离，再用酚和甲醛灭活立克次体制备灭活疫苗。遗憾的是，追踪研究15年后发现该灭活疫苗免疫仅能减轻立氏立克次体感染的临床症状，对降低病死率并不显著[6]。1938年，Herald首次将立氏立克次体在鸡胚卵黄囊中大量繁殖成功，从鸡胚卵黄囊膜中提取立氏立克次体，然后用苯酚和福尔马林将提取的立克次体灭活后制备疫苗[3]。但是，后来的研究证明用鸡胚繁殖立氏立克次体灭活疫苗免疫保护效果也不理想[3]。

表1 SFGR概况一览表[4]Table 1 Known human spotted fever group rickettsial pathogens[4]

接踵而来的失败使斑点热疫苗的研究履步维艰，直到1975年来自美国陆军传染病研究所的Kenyon和Pedersen[7]报道成功地利用鸡胚成纤维细胞培养出纯度很高的立氏立克次体，这一成果为RMSF疫苗的研发注射了一剂强心针。1983年采用灭活鸡胚细胞培养立氏立克次体对疫区志愿者进行免疫接种[3]，结果显示该灭活疫苗可保护四分之一的志愿者，能明显减轻发热等临床症状，增强四环素的治疗效果。尽管该细胞培养立氏立克次体灭活疫苗的保护效果仍不够理想，但是这一研究成果为大量培养立克次体奠定了基础，给RMSF疫苗的研发带来新的希望。

2 减毒活疫苗

与灭活疫苗比较，减毒活疫苗具有用量少、免疫持久、不良反应少等优点，但是由于减毒活疫苗有可能在体内突变而出现毒力增强的危险，烈性传染病减毒活疫苗的研究应非常谨慎。SFGR的致病能力千差万别，即便是同一种立克次体，不同菌株的致病能力也可明显不同，同一株立克次体对人和动物的病理损伤也不尽相同[8]。虽然减毒贝氏柯克斯体做Q热疫苗[9]以及普氏立克次体弱毒株（E株）做流行性斑疹伤寒疫苗[10]已有报道，但斑点热减毒活疫苗的研究还未见报道。

3 亚单位疫苗

随着20世纪70年代后蛋白质和基因分析等生物学技术的快速发展，以及免疫保护效能评价方法的改善，使得许多立克次体保护性抗原得到识别。斑点热疫苗的研究热点从灭活疫苗转向亚单位疫苗。特别是最近德克萨斯大学医学部学者采用反向疫苗学体外筛选和体内筛选相结合法鉴定出能被CD8+T淋巴细胞识别的4个普氏立克次体保护性抗原[11]，它们除能诱导小鼠产生抗普氏立克次体引起的流行性斑疹伤寒外，还能诱导交叉保护对抗莫氏立克次体引起的地方性斑疹伤寒，为筛选抗立克次体保护性抗原及研发亚单位疫苗提供新的有效途径。

3.1 外膜蛋白A（OmpA）和外膜蛋白B（OmpB）

1944年Topping和Shear[12]从乙醚处理后的立氏立克次体中发现了群特异的“可溶性”补体结合抗原。2年后，Shepard和Wyckoff[13]通过电镜技术证明“可溶性”抗原来自立克次体细胞膜。1974年，美国疾病预防控制中心利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）技术对乙醚处理后的立氏立克次体进行研究，发现“可溶性”抗原包含9个分子量为28～150 kDa的蛋白，立氏立克次体至少含有30多种分子量为23～155 kDa的蛋白，其中分子量为 120 kDa（OmpB）和 155 kDa（OmpA）的 2 个蛋白为高丰度膜蛋白[14]，以后的研究证明其在立克次体粘附和入侵宿主细胞等致病性方面发挥着重要的作用[15]。此外，OmpA已被证实可用作SFGR基因型和亚型之间的鉴别[16]。

1985年有研究用立氏立克次体单克隆抗体被动免疫小鼠，发现仅仅针对170 kDa（OmpA）和133 kDa（OmpB）2个大分子的单克隆抗体具有特异性免疫保护效能[17]。之后用立氏立克次体重组OmpB免疫豚鼠，攻毒后显示免疫豚鼠能有效抵抗立氏立克次体的攻击[18]。Feng等[19]用立氏立克次体重组OmpA和OmpB分别免疫小鼠，发现这2种免疫血清均能中和立氏立克次体毒性，用立氏立克次体或康氏立克次体OmpA或OmpB单克隆抗体被动免疫小鼠能够提供小鼠对抗同源立克次体攻击的有效保护。在立克次体感染过程中，Fc受体介导的免疫效应功能[19]和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[20]与巨噬细胞的吞噬调理有关[21]。研究证明Fc依赖的特异性抗体可诱导宿主细胞产生调理素[22]、一氧化氮和过氧化氢来抑制立克次体感染内皮细胞和吞噬细胞[23]。

许多研究发现OmpA和OmpB特异性抗体在抑制SFGR粘附和入侵宿主细胞过程中起着重要作用，但是大量研究也证实清除寄生于胞内的立克次体主要依赖特异性细胞免疫反应。用立氏立克次体OmpA的DNA片段做疫苗，结果免疫小鼠能抵抗亲缘关系较远的康氏立克次体的攻击；同时发现该DNA疫苗能刺激T淋巴细胞产生高水平的干扰素（interferon,IFN）γ，提示OmpA特异的细胞免疫提供了交叉保护[24]。此外，用康氏立克次体感染小鼠，发现CD8+T淋巴细胞尤其是细胞毒性T淋巴细胞在清除小鼠体内立克次体时甚至比CD4+T淋巴细胞更重要[25]。随后发现高水平的OmpA和OmpB特异性抗体出现在立克次体感染恢复期[19]，提示出现较晚的特异性抗体主要在对抗立克次体再次感染时起重要作用，而对抗原发性立克次体感染主要依赖特异性细胞免疫。

3.2 Adr1、Adr2和YbgF 随着蛋白质组学和基因组学的蓬勃发展，21世纪伊始已有几种新的细胞表面蛋白陆续被发现。2006年，法国学者率先通过蛋白质组学技术发现了立克次体粘附素Adr1和Adr2，证明二者在立克次体粘附与入侵中扮演着重要的角色，拓展了斑点热亚单位疫苗的研究领域[26]。2011年，该团队进一步研究发现普氏立克次体外膜蛋白Adr2在立克次体粘附和入侵宿主细胞过程中起关键作用[27]。

近年来，我国温博海团队通过细胞表面蛋白质技术成功鉴定出黑龙江立克次体表面蛋白YbgF以及立氏立克次体表面蛋白Adr1、Adr2和YbgF，并用透射免疫电镜技术首次对其进行了亚细胞定位[15，28]。将这些表面蛋白分别免疫小鼠，用定量PCR分析其肝、脾、肺等立克次体感染靶器官的立克次体载量，结果显示rYbgF和rAdr2蛋白可提供小鼠特异性免疫保护，有效抵抗致死量黑龙江立克次体或立氏立克次体的感染。最近，该团队证明重组立氏立克次体蛋白抗原rAdr2和rOmpB的联合免疫保护效能显著好于rAdr2和rOmpB单抗原免疫[29]。随后他们研究了这些立氏立克次体保护性抗原的免疫保护机制，发现抗原特异的CD4+和CD8+T淋巴细胞经立氏立克次体保护性抗原刺激后能产生高水平的IFNγ和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α，提示这些保护性抗原均能刺激抗原特异性CD4+Th1淋巴细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞迅速产生和分泌大量IFNγ和TNF-α，提示特异性细胞免疫应答在该抗原诱导的特异性免疫保护中起关键作用[29-31]。

4 DNA疫苗

随着如火如荼的亚单位疫苗研发，立克次体DNA疫苗的研究开始初现端倪。2001年研究报道选取立氏立克次体OmpA的1个片段构建重组结核分枝杆菌疫苗和重组DNA疫苗，用其免疫小鼠，结果发现二者抗康氏立克次体感染保护率分别为67%和55%，当DNA疫苗免疫后再用蛋白疫苗加强免疫时保护率上升至75%[24]。2003年美国马里兰州大学用普氏立克次体入侵相关基因invA、细胞分裂相关基因fts、蛋白分泌相关基因sec、毒力相关基因 ompA、ompB、virB、cap、tlyA 及 tlyC 成功构建重组DNA质粒[32]，但是这些DNA质粒的免疫保护效能未见评价。2007年美国学者完成了立氏立克次体强毒株“Sheila Smith”全基因组的测序，次年完成了弱毒株“Iowa”全基因组测序[33]，比较二者的全基因组序列将为研发RMSFDNA疫苗和其他分子疫苗奠定重要基础。

5 表位肽疫苗

尽管OmpA、OmpB、Adr2和YbgF等细胞表面蛋白先后被发现并证明是免疫保护性抗原，但其诱导机体产生的免疫应答不能持久，如要获得较为持久的特异性免疫应答势必要加大免疫剂量和次数，随之增加的不良反应和有限的保护效能成为亚单位疫苗发展的瓶颈。

随着免疫学和生物信息学技术的不断发展，人们发现免疫细胞通常仅识别抗原分子上的一个特定氨基酸序列即表位（epitope），又称为抗原决定簇。表位又可分为T淋巴细胞表位和B淋巴细胞表位，分别诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答。抗原表位的鉴定对研发表位肽疫苗具有重要意义[34]。

虽然针对立克次体的表位肽疫苗近几年才走进人们的视野，但是相关研究却要追溯到1991年，美国沃尔特里德陆军研究所团队利用SDS-PAGE分析恙虫病立克次体表面抗原时，找到了一系列大小为18～35 kDa的蛋白，其中1个22 kDa的蛋白引起了他们的注意[35]。通过计算机分析其氨基酸序列，发现了潜在的B淋巴细胞和T淋巴细胞表位。此后数十年，由于亚单位疫苗的兴起使得处于萌芽状态的表位肽疫苗研究被束之高阁。直到2003年重启表位肽疫苗的研究，从康氏立克次体OmpB蛋白中筛选出5条能够刺激CD8+T淋巴细胞分泌IFNγ的表位肽，进一步研究发现其中3条不仅能刺激CD8+T淋巴细胞增殖并分泌IFNγ，而且还可促进特异性细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用[36]。2006年，英国爱丁堡大学在研究立克次体进化时指出，OmpA和OmpB蛋白在历经自然选择后，立克次体的许多至关重要的氨基酸序列比较集中地出现在某几个区域，而这些区域很可能就是表位肽的隐身之处[37]。

6 展 望

从灭活疫苗到表位肽疫苗，斑点热疫苗的研究已走过了100多年的历程。灭活疫苗作为斑点热疫苗研究的鼻祖有着重要的意义，但由于其制备难度高、不良反应大、保护率低等不得不存封在历史的记忆中。亚单位疫苗虽然弥补了灭活疫苗的很多不足，但是其免疫保护效果仍与人们的目标相差甚远。最新研究证明多保护性抗原组合或T和B淋巴细胞表位肽组合能够诱导机体产生更全面的免疫应答和更强的特异性抵抗，同时具有安全、可靠、生产方便的特点，为斑点热分子疫苗的研发展现了美好前景。

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