慢性HBV感染者不同病程阶段HBV前S基因缺失突变的比较分析

秦雅群，李晓东，廖 昊，李 梵，卢珊珊，刘 妍，徐东平，李 进

我国现有HBV感染者约9300万人，其中约2000万人为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者[1]。HBV感染后临床可表现为急性自限性肝炎、无症状 HBV 携带、CHB、肝硬化（liver cirrhosis,LC）、慢加急性肝衰竭（acute－on－chronic liver failure,ACLF）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[2]。但是，HBV感染疾病进展的相关机制尚未完全阐明，除受感染年龄影响外，与机体免疫系统和病毒的相互作用密切相关[3]。

HBV为部分环状双链DNA，其基因组包含了S、P、C和X 4个开放读码区。S读码区分为前S（pre-S）1基因、pre-S2基因和S基因，各有其起始密码子，但共用同一终止密码子。核苷酸（nt）序列分别为 nt 2848-3204、nt 3205-154和 nt 155-835，分别编码119个pre-S1蛋白、55个pre-S2蛋白及226个S蛋白。pre-S1和pre-S2蛋白包含多个T细胞和B细胞表位，与机体的免疫反应有密切的相互作用[4]。近年来不断深入的研究发现，pre-S基因的缺失突变可能导致病毒的感染性、分泌能力、免疫原性及抗原抗体的结合能力发生改变。首先，pre-S基因的缺失可能使大蛋白在细胞表达过量，并在细胞中堆积，导致细胞形态的改变，从而加重疾病的进展，多项临床研究均发现pre-S缺失突变与LC和HCC密切相关[5-7]。其次，HBV感染的决定区域位于pre-S1蛋白N端，通过与肝细胞表面牛磺胆酸共转运多肽结合以感染肝细胞[8]；pre-S2蛋白包含多聚人血清ALB结合位点，在病毒装配的过程中起关键作用[9]。此外，HBV pre-S基因有SP1和SP2两个启动子，其中SP2（nt2809-3152）大部分位于pre-S1基因内，pre-S1缺失突变可影响SP2活性，进而影响中蛋白和小蛋白合成[10]。目前尚缺少针对慢性HBV感染者疾病进展的不同阶段进行pre-S基因测序的研究，本研究对较大样本量的CHB、LC、ACLF和HCC患者进行pre-S基因测序，并比较不同病程阶段患者的pre-S缺失发生率以及发生缺失的热点区域差异，以阐明HBV pre-S1和pre-S2基因缺失突变的临床流行特点及其各自与疾病进展的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 样本来源于2009年7月—2013年6月在解放军第三〇二医院就诊的539例乙型肝炎患者，包括CHB患者146例（CHB组），LC患者111例（LC组），ACLF患者 146例（ACLF组），HCC患者136例（HCC组）。诊断按照相应指南进行[11-12]，排除HIV、HDV等混合感染者、酒精性肝病患者及自身免疫性肝病患者。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA的提取 采用绵阳高新区天泽基因工程有限公司生产的DNAout试剂。

1.2.2 HBV pre-S基因的扩增及测序 2轮巢式PCR扩增pre-S基因（nt2848-154）。第1轮扩增的上 游 引 物 为 PSFU1：5'-CCCTCGCCTCGCAGACGAAG-3'；下游引物为 PSFD1：5'-TTGGAGGACAA－

GAGGTTGGTGA-3'。第2轮扩增的上游引物为PSU12：5'-AGCGCCTCATTTTGTGGGTC-3'；下游引物 为 PSD42：5'-TGTAACACGAGCAGGGGTCC-3'。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（0.7%琼脂糖、1×Super Buffer，210 V，5min）鉴定后，送北京天一辉远生物科技有限公司进行DNA序列测定，每个样品均进行正、反双向测序。用Vector NTI8.0软件对序列测定峰图结果进行比对，并对每个位点的序列峰图依次进行分析，对正、反双向测序结果进行比较印证。

1.2.3 pre-S基因缺失突变和缺失热点区域分析 将测序获得的序列与NCBI genotyping tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi）收录HBV/C基因型全基因组标准序列的pre-S和S基因相比较（序列号AB014381），鉴定pre-S基因缺失突变。与标准序列相比，pre-S基因发生3个碱基及以上的缺失鉴定为缺失突变。1.2.4 相关指标的检测 HBV DNA应用实时荧光PCR进行定量测定，检测仪器为罗氏Light Cycler 480Ⅱ检测仪。血清HBsAg水平用电化学发光法进行检测。ALT和TBIL水平采用Olympus AU 5000自动分析仪进行测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。定量数据呈正态分布，用x±s表示，缺失片段长度用中位数（最小值，最大值）表示。定量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较用q检验；多组定性数据比较采用R×Cχ2检验，两两比较用Scheffe法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组基本临床资料 4组患者性别组成差异无统计学意义。年龄方面，HCC组高于CHB组（P＜0.05）。血清HBV DNA水平方面，HCC组高于LC组（P＜0.05）。各组ALT水平差异有统计学意义，ACLF组＞CHB组＞LC组＞HCC组。TBIL水平方面，ACLF组显著高于其他3组，CHB组高于LC组和HCC组（P均＜0.05）。见表1。

2.2 4组pre-S基因缺失率比较 4组患者pre-S基因总体缺失率差异有统计学意义，HCC组和LC组显著高于CHB组（P＜0.05）；4组pre-S1基因缺失率差异有统计学意义，LC组显著高于CHB组（P＜0.05）；4组pre-S2基因缺失率差异有统计学意义，HCC组显著高于CHB组（P＜0.05）。见表2。

2.3 4组S基因缺失热点区域比较 通过分析不同病程阶段患者pre-S基因序列，发现pre-S1基因翻译起始位置（nt2849-2866）和pre-S2基因翻译起始位置（nt 5-55）是最常发生缺失的位置；不同病程阶段患者缺失发生热点也不相同（表3）。以CHB组为例，146例CHB患者中有23例发生pre-S总体缺失，其中nt3031-3215和nt24-57为缺失最常发生的区域，各有7例（30.4%）。不同病程阶段患者pre-S基因缺失片段长度差异无统计学意义。

表1 4组基本临床资料比较Table 1 Com parison of clinical data among 4 groups of patients w ith different illness categories

表2 4组pre-S基因缺失率比较［例(%)］Table 2 Comparison of deletion rates of pre-S gene among 4 groups of patients w ith different illness categories[cases(%)]

表3 4组发生缺失突变的热点区域及缺失片段长度Table 3 Hot spots and fragment lengths of deletion mutation in 4 groups of patients w ith different illness categories

3 讨 论

慢性HBV感染者病情的临床转归与病毒、宿主及环境因素密切相关[2]。在感染者体内，HBV核酸成分容易发生变异，引起病毒生物学特点的变化，其结果可导致疾病的慢性化并不断诱导肝细胞炎性损害，增加产生新的HBV基因变异的机会；同时变异病毒毒力增强和抗原表位发生改变，可能引起过度免疫应答反应，造成严重的肝细胞损伤，使得慢性HBV感染者疾病进展[3]。HBV pre-S区是变异最大的区域，易影响机体的免疫反应以及病毒复制力和致病性，从而影响疾病的发生和发展过程。既往研究表明，不同国家及人群的pre-S缺失检出率存在明显差异。Chen等[13]研究12个国家pre-S突变流行率，发现中国乙型肝炎患者pre-S缺失检出率平均为22.4%，日本pre-S缺失检出率为23%。韩国学者Mun等[14]检测了120例乙型肝炎不同疾病程度的患者，发现总体pre-S缺失率为30.8%。在本研究中，我国乙型肝炎相关患者的总体缺失率为24.1%，与以往研究结果相似。

一般来讲，乙型肝炎患者感染病毒的时间越长，体内越容易积累病毒变异。考虑到我国乙型肝炎患者很多是母婴垂直传播，患者的年龄一定程度上可以反应患者的感染时间。本研究中4组患者的年龄总体上有差异，但两两比较的结果显示仅HCC组患者的年龄高于CHB组患者，LC组和ACLF组与CHB组相比并无差别；本研究的病例样本较大，可在一定程度上平衡年龄差别带来的病毒变异差异，后续工作中我们将进行进一步的配对分层比较。

目前公认pre-S基因缺失与LC和HCC都有密切关系，但pre-S1和pre-S2基因缺失各自的临床意义却存在争议。pre-S1和pre-S2基因包含的功能区域不一样，因此缺失引起疾病进展的模式也可能存在差异。pre-S1基因涵盖位点多为与病毒生活周期相关的位点，包含与宿主受体结合的功能域；而pre-S2基因涵盖大量的T细胞和B细胞表位，对免疫压力的反应更活跃[7]。一般认为pre-S2缺失突变是HCC的高风险因素，有研究显示pre-S2缺失突变可能使得大蛋白、中蛋白和小蛋白比例失调，大蛋白在肝细胞内质网上过量产生和滞留，增加了内质网压力，导致宿主基因不稳定，增加DNA损伤和基因突变频率，造成肝细胞进一步损伤及 HCC 的发生[7，15-16]。但也有 Mun等[14]研究发现pre-S1缺失突变更常出现在HCC患者中，而pre-S2缺失突变则更常在LC患者中检测到，破坏pre-S1起始密码的缺失突变在HCC进展中起重要作用。本研究结果显示，LC患者pre-S1基因缺失率显著高于CHB患者，而HCC患者pre-S2缺失率则显著高于CHB患者，与多数研究的共识一致。该结果提示pre-S1和pre-S2基因缺失突变的致病机制存在差异，pre-S1基因缺失突变与LC更为相关，而pre-S2基因缺失突变则可能参与了HCC癌变进程。

既往研究中pre-S基因任意片段和任意位置的缺失都统称为pre-S基因缺失突变，较少将pre-S缺失的位置和缺失片段长度与疾病进展关联起来。本研究较为系统地比较了不同病程阶段患者的缺失发生热点区域和缺失片段长度的差异。结果发现4组患者发生缺失的热点区域各不相同：CHB患者的缺失突变多发生在pre-S1蛋白C末端，LC和ACLF患者多发生在pre-S1蛋白的翻译起始端（N端），HCC患者则多发生在pre-S2蛋白的翻译起始位置。这种缺失位点的差异可能与pre-S1和pre-S2蛋白所承担的不同功能相关。此外，4组患者的缺失片段长度的差异无统计学意义，该结果提示缺失长度可能与疾病进展并无直接关系。

综上所述，本研究根据患者不同病程阶段，分组分析了较大样本量慢性HBV感染者pre-S基因缺失突变的临床检出率及其临床意义，发现慢性HBV感染者中，随着疾病进展pre-S基因缺失率呈上升趋势，其中pre-S1基因缺失突变与LC更为相关，而pre-S2基因缺失突变则可能参与了肝脏癌变进程。pre-S基因缺失突变热点区域为pre-S1和pre-S2基因的翻译起始位置。此外，pre-S基因缺失的片段长度可能并不影响疾病进展，但pre-S基因缺失的位置则可能对疾病进展产生影响。pre-S1和pre-S2缺失突变在LC和HCC发生和发展过程中的作用机制还有待进一步研究阐明。

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