联合应用泛素分子基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

张 亮，于 澜，叶 伟，李璞媛，张芳琳，程林峰

汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）隶属于布尼亚病毒科汉坦病毒属。1976年，韩国学者李镐汪于该国疫区汉滩河流域黑线姬鼠的肺组织中首次成功分离该病毒[1]。该病毒主要宿主为鼠类等啮齿类动物，一般通过动物排泄物污染而经由呼吸道、消化道及破损的皮肤等途径传播给人类，引起肾综合征出血热（hemorrhagic feverwith renalsyndrome,HFRS）[2]，主要临床表现为发热、出血和急性肾损伤[3]。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家之一，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点[4-5]。由于HFRS的宿主广泛，传播途径多，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因此其防治任务十分艰巨。近年来，国内外虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从应用情况来看，该类疫苗仍存在一些不足：主要是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱，刺激机体产生的细胞免疫应答欠佳以及存在一定的安全性隐患等缺点[6]。因此，HFRS新型基因工程疫苗的研发一直是HFRS预防领域的研究热点。

在HFRS基因工程疫苗的研究中，目前主要是利用HTNV包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）作为抗原组分[7]。GP是HTNVM基因编码的重要结构蛋白，由Gn和Gc两个糖蛋白组成，研究表明，HTNV的多数中和抗原位点集中在GP上，但是GP的免疫原性相对较弱，刺激机体产生的中和抗体出现较晚，且滴度不高，而中和抗体在抗HTNV感染中至关重要[8]；NP由病毒S基因编码，虽然免疫原性强，但其中和抗原位点少，主要刺激机体产生特异性细胞免疫应答[9-10]。本课题组前期研究发现，NP的抗原位点主要位于HTNVS基因0.7 kb片段（即编码NP氨基端aa1～274片段，S0.7）上，且该截短片段与完整NP对机体的免疫效果基本相同[11]。在此基础上，本课题组前期构建了含HTNV S基因0.7 kb片段与Gn或Gc基因的嵌合基因重组腺病毒（rAd－GnS0.7和rAd－GcS0.7），并对腺病毒载体进行了改建，即将其启动子替换为CAG［人巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增强子和β－actin启动子的杂合体］，构建了新的重组腺病毒（rAd－pCAG－GnS0.7和 rAd－pCAGGcS0.7），并证明了新构建的重组腺病毒能显著提高HTNV嵌合基因GnS0.7和GcS0.7的表达水平[12]。

本研究拟在前期已优化转录调控结构的基础上，分别构建含有抗原加工提呈分子泛素（ubiquitin,Ub）基因的HTNV嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重组腺病毒，并对表达产物进行初步鉴定，以期进一步提高嵌合基因表达抗原的加工和提呈，特别是进一步提高刺激体液以及细胞免疫应答的能力。

1 材料与方法

1.1 材料 pShuttle腺病毒转移载体及Adeno－XTM ExpressionSystem购自Clontech公司（Mountain View，CA，USA）。Teasy载体购自Promega公司（Madison，WI，USA）。 pShuttle－pCAG －GnS0.7 和 pShuttlepCAG－GcS0.7重组转移载体由本室李璞媛博士构建[12]。pCMV－F3Ub质粒（含泛素基因）由 J.LindsayWhitton博士（Scripps Research Institute）惠赠。限制性内切酶PI－SceⅠ和I－CeuⅠ购自New England Biolabs公司。LipofectamineTM2000 Reagent购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。胶回收试剂盒购自TaKaRa公司（大连，辽宁，中国），腺病毒滴度测定试剂盒Adeno－XTMRapid Titer Kit购自Clontech公司。HEK293细胞由本室保存。小鼠源性mAb 6F7（抗HTNV Gn）由中国疾病预防控制中心赠送，LV48（抗HTNV Gc）由病毒病预防控制所赠送，1A8（抗 HTNVNP）由本室制备[13]。小鼠源性的抗Ub抗体购自亿欣生物科技有限公司（上海，中国）。FITC标记的兔抗小鼠二抗购自中杉生物科技公司（西安，陕西，中国）。

1.2 方法

1.2.1 PCR 扩增获得Ub基因 依据GenBank中的Ub序列设计引物，送至金斯瑞生物科技有限公司合成（南京，江苏，中国）。Ub forward primer：（含SfiⅠ位点）5'－GACGGCCTCGACGGCCATGCAGATTTTCGTGAAG－3'；Ub reverse primer：（含 Nhe Ⅰ位点）5'－GACGCTAGCCTACTTACTTAAGATCTG －3'。以Ub forward primer和Ub reverse primer为引物，以pCMV－F3Ub为模板，进行PCR扩增。将扩增后的PCR产物与T easy载体14℃连接过夜，连接产物电转化E.coli JM109后涂布含Amp抗性的琼脂平板，37℃培养12 h，挑选单菌落增菌，提取质粒后以Ub forward primer和Ub reverse primer为引物进行PCR鉴定，获得阳性克隆，命名为T easy－Ub，并送金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

1.2.2 构建重组腺病毒转移载体 使用SfiⅠ及Nhe Ⅰ双酶切 pShuttle－pCAG－GnS0.7、pShuttlepCAG－GcS0.7重组转移载体和T easy－Ub质粒，分别胶回收目的片段和载体。将载体与片段14℃连接过夜，连接产物电转化E.coli JM109后涂布含Kan抗性的琼脂平板，37℃培养12 h，挑单菌落增菌，提取质粒后用SfiⅠ及NheⅠ双酶切鉴定，获得阳性克隆，分别命名为pShuttle－pCAG－Ub－GnS0.7和 pShuttle－pCAG－Ub－GcS0.7（Ub 基因位于 GnS0.7和GcS0.7嵌合基因的上游）。

1.2.3 构建重组腺病毒载体 利用限制性内切酶PI－SceⅠ和 I－Ceu Ⅰ分别双酶切 pShuttle－pCAGUb－GnS0.7、pShuttle－pCAG－Ub－GcS0.7 和 Adeno－XTM ViralDNA。胶回收酶切后的目的片段pCAGUb－GnS0.7、pCAG－Ub－GcS0.7 和载体 Adeno－XTMViral DNA。将载体与片段14℃连接过夜，连接产物电转化E.coli JM109后涂布含Amp抗性的琼脂平板，37℃培养12 h，挑单菌落增菌，提取重组腺病毒DNA后进行PCR扩增。分别以Ub forward primer和S0.7 reverse primer（5'－GACACGCGTTTAGAGTTT －AAAGGCT－3'）为引物，对重组腺病毒DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析得到阳性克隆，分别命名为 rAd－pCAG－Ub－GnS0.7 和 rAd－pCAGUb－GcS0.7。

1.2.4 重组腺病毒的包装及鉴定 利用限制性内切酶 PacⅠ消化 rAd－pCAG－Ub－GnS0.7和 rAdpCAG－Ub－GcS0.7，使其线性化。测定浓度后与LipofectamineTM2000混合转染HEK293细胞，待出现明显细胞病变（cytopathic effect,CPE）后收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）。反复冻融3次后离心收集上清，即为重组腺病毒rAd－pCAG－Ub－GnS0.7和rAd－pCAG－Ub－GcS0.7。将重组腺病毒利用蛋白酶K消化后作为PCR的模板，以Ub forward primer和S0.7 reverse primer为引物，对重组腺病毒DNA进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.2.5 重组腺病毒滴度测定及表达产物检测 系列稀释重组腺病毒，进行单斑实验，挑单斑扩增病毒利用Adeno-XTMRapid Titer Kit测定各重组腺病毒的滴度。感染前24 h取HEK293细胞接种于24孔板中，6×105细胞/孔。第2天以感染复数（multiplicity of infection,MOI）=100的病毒量感染细胞，1 h后吸弃病毒液，每孔加入1ml新鲜的10%新生牛血清的PRMI1640培养基培养液，37℃CO2孵箱继续培养48 h。吸弃上清，用PBS轻柔洗涤后，加入200μl4%多聚甲醛固定细胞，室温放置10min。吸去多聚甲醛，用PBS轻柔洗涤3次后，加入200μl 0.5%Triton X-100室温作用10min。吸去Triton X-100，用PBS轻柔洗涤3次后，加入200μl 3%的BSA-PBS室温封闭30min，吸去封闭液。每孔加入200μl稀释好的一抗（mAb Gn-4及Gc-10分别检测Gn和Gc的表达，mAb 1A8检测S0.7的表达，抗Ub抗体检测Ub的表达），4℃孵育过夜。吸弃抗体，用PBS轻柔洗涤3次后分别加入FITC标记的相应二抗，室温避光孵育1 h。用PBS轻柔洗涤6次后，荧光显微镜下观察并采集图像进行分析。

2 结 果

2.1 Ub基因的PCR扩增及测序 以Ub forward primer和Ub reverse primer为引物，对阳性克隆进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，在约250 bp处出现特异条带，与预期符合（图1）。将阳性克隆命名为T easy-Ub并送至金斯瑞生物科技进行测序，利用美国国立生物技术信息中心的BLAST工具与预先获得的Ub序列信息进行比对，一致性达100%。

图1 重组质粒T easy-Ub的PCR鉴定结果A.DL2000 DNAmaker；B.Teasy-Ub PCR 产物Figure 1 PCR products of recombinant plasm id T easy-Ub

2.2 重组腺病毒转移载体的鉴定 使用限制性内切酶SfiⅠ及NheⅠ双酶切重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-Ub-GnS0.7和pShuttle-pCAG-Ub-GcS0.7。如载体构建正确，可将Ub基因（长度250bp）从载体中切下。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，在约250 bp处可见特异条带，与预期相符（图2）。

图2 重组腺病毒转移载体酶切鉴定结果A.DL2000 DNAmaker；B.pShuttle-pCAG-Ub-GnS0.7；C.pShuttle-pCAG-Ub-GcS0.7Figure 2 Restriction enzyme analysis of recombinant adenoviral transfer vectors

2.3 重组腺病毒载体的鉴定 重组腺病毒载体rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7分别以 Ub forward primer和 S0.7 reverse primer为引物进行PCR鉴定，扩增Ub-GnS0.7和Ub-GcS0.7片段，理论长度为2880 bp和2580 bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约3000 bp和2500 bp处出现特异条带，与预期相符（图3）。

图3 重组腺病毒DNA PCR鉴定结果A.DNA wide range maker；B.rAd-pCAG-Ub-GcS0.7；C.rAdpCAG-Ub-GnS0.7Figure 3 PCR products of recombinant adenoviral DNA

2.4 重组腺病毒的鉴定 包装获得的重组腺病毒rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7经过蛋白酶K消化后分别以Ub forward primer和S0.7 reverse primer为引物进行PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约3000 bp和2500 bp处出现特异条带，与预期相符（图4）。

2.5 HEK293细胞的CPE现象 重组腺病毒载体转染HEK293细胞1周后，细胞皱缩变圆并逐渐脱落，随着病毒的增殖，细胞核占据了细胞的大部分，此时出现明显CPE（图5）。

图4 重组腺病毒PCR鉴定结果A.DNA wide rangemaker；B.rAd－pCAG－Ub－GcS0.7；C.rAdpCAG－Ub－GnS0.7Figure 4 PCR products of recombinant adenovirus

图6 重组腺病毒rAd-pCAG-Ub-GnS0.7的免疫荧光鉴定结果（×200）A.mAb Gn－4检测结果；B.mAb 1A8检测结果；C.抗Ub抗体检测结果；D.正常对照（采用上述3种抗体混合物检测）Figure 6 Indirect immunofluorescence assay of HEK 293 cells infected w ith recombinant adenoviruses rAd-pCAGUb-GnS0.7 （×200）

图7 重组腺病毒rAd-pCAG-Ub-GcS0.7的免疫荧光鉴定结果（×200）A.mAb Gc－10检测结果；B.mAb 1A8检测结果；C.抗 Ub抗体检测结果；D.正常对照（采用上述3种抗体混合物检测）Figure 7 Indirect immunofluorescence assay of HEK 293 cells infected w ith recombinant adenoviruses rAd-pCAGUb-GcS0.7 （×200）

图5 HEK 293细胞的CPE现象（×40）A.未转染正常细胞对照；B.转染1周后细胞出现CPE；C.单独添加转染试剂对照Figure 5 CPE of HEK 293 transfected w ith recombinant adenoviral DNA （×40）

2.6 表达产物的免疫荧光检测 采用免疫荧光法，对重组腺病毒 rAd－pCAG－Ub－GnS0.7 和 rAdpCAG－Ub－GcS0.7感染HEK293细胞后目的蛋白（Gn、Gc、S0.7和Ub）的表达进行了检测。结果显示均可见特异性绿色荧光，证明重组腺病毒rAdpCAG－Ub－GnS0.7 和 rAd－pCAG－Ub－GcS0.7 成功表达了各目的蛋白（图6～7）。

3 讨 论

Ub－蛋白酶复合体通路是细胞内源性蛋白降解的主要途径，同时也是内源性抗原加工、处理和提呈的主要途径。Ub是一种由76个氨基酸组成的蛋白质分子，其C端为Gly。当要降解的底物蛋白被识别后，Ub末位Gly与靶蛋白上的Lys残基共价结合，形成多聚Ub－底物蛋白复合物，该复合物最终被蛋白酶体降解。细胞内蛋白降解时须连接Ub分子。Ub－蛋白酶体系统（Ub－proteasome system,UPS）参与免疫反应的直接体现是UPS在APC通过主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）－Ⅰ途径提呈抗原的过程中发挥重要作用。在抗原肽的提呈过程中，细胞内质网中的肽段密度是决定MHC－Ⅰ类复合物成熟的重要因素。增强肽段的递送可加快细胞表面成熟的MHC－Ⅰ类复合物的表达。目前已确定通过MHC－Ⅰ类途径提呈的肽段大部分都是通过UPS产生的[14]。UPS中的一种环状多片层结构蛋白PA28，可结合到UPS的核心蛋白酶－20S的末端，极大地增强UPS水解寡肽的能力，从而产生适合MHC－Ⅰ提呈的低聚肽[15]。UPS系统还可使寡肽产生MHC－Ⅰ提呈所需的特异的C末端，之后由细胞质中的氨基肽酶对寡肽的N末端进行修饰使其适合与MHC－Ⅰ结合。

UPS还与免疫调节有关。核因子Kappa B（nuclear factor－kappa B,NF－κB） 是许多促炎症细胞因子的调节剂，NF－κB 的激活受 UPS 的调节，NF－κB的前体较大，须经过UPS的降解修饰成为有功能的NF－κB。此外，NF－κB 由于在正常状态下被 IκB 结合而活性受到抑制，UPS使IκB泛素化，使NF－κB的核定位信号暴露，NF－κB转位到细胞核内发挥特异性转录因子的作用，激活应答炎症与感染的基因，产生细胞因子、炎症应答蛋白、免疫受体等[16]。因此，Ub直接关系着MHC－Ⅰ类复合物的形成及免疫调节，进而影响着细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）途径。Rodriguez 等[17]研究发现将Ub与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原共同表达，可提高该抗原在细胞内的降解，使更多肽段进入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径，增加进入MHC-Ⅰ途径的表位肽，从而诱导强烈的MHC-Ⅰ限制的CTL和Thl类细胞应答的细胞免疫反应。Wang等[18]将结核分枝杆菌的ESAT-6基因与Ub基因融合后构建DNA疫苗，测定其Th1型细胞因子的水平及T淋巴细胞增殖现象，发现其指标均高于未融合Ub基因组，同时其IgG2a、IgG1及CTL的水平也得到提高。Brandsma等[19]将兔乳头瘤病毒的早期基因与Ub基因构建入真核表达载体，导入后可抑制无症状感染兔体内乳头瘤的发生，已感染并且产生乳头瘤的兔体内的肿瘤体积也可通过注射该载体而显著减小。研究显示将Ub基因与抗原基因融合表达时，须使Ub基因位于抗原基因的上游，在表达后即可形成稳定的poly-Ub-antigen复合物，迅速被蛋白酶复合体识别，进入降解与提呈阶段。Tang等[20]将Ub基因和旋毛虫抗原基因构建入pVAX载体，免疫机体后测定其Th1型细胞因子的水平，发现其指标均高于未融合Ub基因组，且CTL的水平也得到有效提高。Ou等[21]构建了含有Derp1基因与Ub基因的DNA疫苗，免疫小鼠后发现Ub可以大大提高该DNA疫苗的免疫效力。本研究基于上述研究结果将Ub基因构建在HTNV嵌合抗原基因的上游，以期进一步提高嵌合基因表达抗原的加工和提呈以及刺激机体的特异性免疫应答的能力。

本实验证实构建的含有Ub基因的HTNV嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重组腺病毒均能很好地表达融合蛋白，下一步我们将通过动物实验来进一步验证Ub是否能够有效地促进HTNV融合蛋白GnS0.7和GcS0.7刺激机体的特异性免疫应答。

[1]Lee HW,Lee PW,Johnson KM.Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever［J］.J Infect Dis,1978,137(3):298-308.

[2]Easterbrook JD,Klein SL.Immunological mechanisms mediating hantavirus persistence in rodent reservoirs［J］.PLoSPathog,2008,4(11):e1000172.

[3]Yi J,Xu Z,Zhuang R,et al.Hantaan virus RNA load in patients having hemorrhagic fever with renal syndrome:correlation with disease severity［J］.J Infect Dis,2013,207(9):1457-1461.

[4]Zhang YZ,Zou Y,Fu ZF,et al.Hantavirus infections in humans and animals,China［J］.Emerg Infect Dis,2010,16(8):1195-1203.

[5]Watson DC,Sargianou M,Papa A,et al.Epidemiology of Hantavirus infections in humans:a comprehensive,global overview［J］.Crit Rev in Microbiol,2013,40(3):261-272.

[6]Schmaljohn C.Vaccines forhantaviruses［J］.Vaccine,2009,27(Suppl 4):S61-S64.

[7]Yoshimatsu K,Yoo YC,Yoshida R,et al.Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus-expressed proteins［J］.Arch Virol,1993,130(3-4):365-376.

[8]Wang M,Pennock DG,Spik KW,et al.Epitope mapping studies with neutralizing and non-neutralizingmonoclonal antibodies to the G1 and G2 envelope glycoproteins of Hantaan virus［J］.Virology,1993,197(2):757-766.

[9]Woo GJ,Chun EY,Kim KH,et al.Analysis of immune responses against nucleocapsid protein of the Hantaan virus elicited by virus infection or DNA vaccination［J］.JMicrobiol,2005,43(6):537-545.

[10]Lindkvist M,Lahti K,Lilliehöök B,et al.Cross-reactive immune responses in mice after genetic vaccination with cDNA encoding hantavirus nucleocapsid proteins［J］.Vaccine,2007,25(9):1690-1699.

[11]薛小平，徐志凯，马文煜，等.汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析［J］.中国病毒学，2000，15(3):220-225.

[12]Li PY,Yu L,Wu XA,etal.Modification of the adenoviral transfer vector enhances expression of the Hantavirus fusion protein GnS0.7 and induces a strong immune response in C57BL/6 mice［J］.J Viroll Methods,2012,179(1):90-96.

[13]梁米芳，宋干，杭长寿，等.流行性出血热病毒单克隆抗体的特性鉴定及其对病毒结构蛋白作用的初步研究［J］.病毒学报，1989，5(3):217-224.

[14]Rock KL,Gramm C,Rothstein L,et al.Inhibitors of the proteasome block the degradation ofmost cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class Imolecules［J］.Cell,1994,78(5):761-771.

[15]Saric T,Chang SC,Hattori A,et al.An IFN-gamma-induced aminopeptidase in the ER,ERAP1,trims precursors to MHC class I-presented peptides［J］.Nat Immunol,2002,3(12):1169-1176.

[16]Wang J,Maldonado MA.The Ubiquitin-proteasome system and its role in inflammatory and autoimmune diseases［J］.Cell Mol Immunol,2006,3(4):255-261.

[17]Rodriguez F,Zhang J,Whitton JL.DNA immunization:ubiquitination of a viral protein enhances cytotoxic T-lymphocyte induction and antiviral protection but abrogates antibody induction［J］.JVirol,1997,71(11):8497-8503.

[18]Wang QM,Kang L,Wang XH.Improved cellular immune response elicited by a ubiquitin-fused ESAT-6 DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis［J］.Microbiol Immunol,2009,53(7):384-390.

[19]Brandsma JL,Shlyankevich M,Zelterman D,et al.Therapeutic vaccination of rabbits with a ubiquitin-fused papillomavirus E1,E2,E6 and E7 DNA vaccine［J］.Vaccine,2007,25(33):6158-6163.

[20]Tang F,Xu L,Yan R,et al.A DNA vaccine co-expressing Trichinella spiralis MIF and MCD-1 with murine ubiquitin induces partial protective immunity in mice［J］.JHelminthol,2013,87(1):24-33.

[21]Ou J,ShiW,Xu Y,etal.Intranasal immunization with DNA vaccine coexpressing Der p 1 and ubiquitin in an allergic rhinitis mousemodel［J］.Ann Allergy Asthma Immunol,2014,113(6):658-665.