海南苦丁茶多糖的提取及对红细胞溶血的保护作用研究

于淑池，王 珮，许琳琅，王海娟，周稳平

(琼州学院 食品学院，海南 三亚 572022)



海南苦丁茶多糖的提取及对红细胞溶血的保护作用研究

于淑池，王 珮，许琳琅，王海娟，周稳平

(琼州学院 食品学院，海南 三亚 572022)

采用正交试验优化水提法提取海南苦丁茶中茶多糖，并研究了苦丁茶多糖在体外对人血红细胞自氧化和H2O2所致红细胞氧化溶血保护作用。结果表明：影响苦丁茶多糖提取率的因素主次关系为浸提温度> 浸提时间>乙醇浓度>料液比。正交试验最佳条件为：浸提温度为85℃，乙醇浓度为75%，浸提时间为1.5h，料液比为1∶15，此条件下的多糖提取率为3.53%。海南苦丁茶多糖在体外能够明显抑制人血红细胞自氧化溶血作用，随着茶多糖浓度的增加抑制红细胞的自氧化溶血作用也逐渐增强，茶多糖浓度为200μg/mL-400μg/mL时，溶血度下降趋势平缓，当浓度大于400μg /mL时溶血度迅速下降，抗氧化活性迅速上升，当茶多糖浓度达到600μg /mL时与200μg/mL的Vc保护作用相近；茶多糖对H2O2所致红细胞的溶血度也具有保护作用，随着茶多糖浓度的增加，抑制H2O2所致红细胞的氧化溶血作用也逐渐增强，茶多糖的保护作用均比相同浓度下的Vc溶液弱。

苦丁茶；茶多糖；正交试验；红细胞溶血

0 引言

海南苦丁茶属冬青科的苦丁茶冬青种[1],为冬青科常绿乔木,主要分布于我国南方等省区.是海南的特色名片,茶多糖 ( tea polysaccharide，简称 TPS)是茶叶中继茶多酚之后发现的又一种重要的生理活性物质.研究表明,苦丁茶多糖具有良好的抗菌、降血脂、降血压、清除自由基等作用[2-3].海南正规的苦丁茶生产企业约有存茶2000多吨.苦丁茶原料充足.具有极大的开发价值.茶叶的深加工与综合利用是未来茶产业可持续发展的关键所在.本课题通过正交设计,研究从海南苦丁茶中高效提取茶多糖的的工艺.采用红细胞自氧化溶血、双氧水诱导红细胞氧化溶血实验来研究茶多糖的抗氧化活性.目前对苦丁茶多糖提取工艺研究的报道较多[4-6]，吕爱华等[7]还将茶多糖制成胶囊服用,彭晓辉[8]、杨军国等[9]研究了苦丁茶多糖的降血糖作用,但苦丁茶对人血红细胞溶血的保护作用研究未见报道,因此本课题的研究为海南苦丁茶的深加工开辟新的途径,为苦丁茶的保健品开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海南苦丁茶(产于海南省五指山)：购自海南三亚南国超市,将苦丁茶在60℃烘箱干燥48h,用粉碎机将干燥后的苦丁茶粉碎,过60目筛,得到苦丁茶粉末备用.葡萄糖、浓硫酸、无水乙醇、乙醚、双氧水、维生素C、三氯乙酸等，以上试剂均分析纯.

1.2 仪器

SKP-01电热恒温干燥箱(湖北省黄石市医疗器械厂)、HWS-26超级恒温水浴槽(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)、FA2204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)、TDL-80-2B离心机(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)、HY-3多用振荡器(金坛市恒丰仪器厂)、UV-2550紫外分光光度计(日本岛津).

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线绘制

采用苯酚- 硫酸比色法测定糖的含量.分别取4、8、12、16、20、24、28μg/mL浓度的葡萄糖溶液 4mL于25mL试管中,加15%苯酚溶液2mL,98%浓硫酸10mL,静置10min,搅拌均匀,20min后于490nm处,测各溶液的吸光值,以葡萄糖质量浓度为横坐标,溶液吸光值为纵坐标,绘制标准曲线.吸光度(y)对葡萄糖质量浓度(x)做回归处理,得到回归方程。Y=0.0393x+0.0076,R2=0.9902.拟合度良好.

1.3.2海南苦丁茶多糖的提取工艺流程

苦丁茶粉浸提液→水浴加热→离心→取上清液→合并上清液→加入TCA脱色除蛋白→震荡30min→离心10min→取上清液→合并上清液→加乙醇沉淀→离心10min→取沉淀的多糖→用无水乙醚与无水乙醇洗涤沉淀→定容显色→测吸光值→计算多糖提取率[10].

1.3.3水浸提法对多糖提取率的影响

选取浸提时间(0.5、1、1.5、2、3h),浸提温度(45、55、65、75、85℃),料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25),乙醇浓度(55、65、75、85、95%)进行单因素实验,计算多糖得率.

在单因素实验的基础上,选用标准L9(34)正交试验表进行试验方案设计,其因素与水平设计见表1.

表1 正交试验因素水平设计

1.4海南苦丁茶多糖对红细胞溶血的保护作用

海南苦丁茶多糖对红细胞自氧化和H2O2所致红细胞氧化溶血的影响.

采用于淑池[11]的方法并有所改进,计算溶血度[12].

1.5 数据处理

2 结果与讨论

2.1 水浸提对海南苦丁茶多糖的单因素考察

2.1.1 浸提温度对多糖提取率的影响 改变浸提温度对多糖提取率的影响如图1所示.其结果表明：不同浸提温度对多糖率的影响比较大.随温度的升高,多糖提取率增大,在65℃时达到最大值,随后又随温度的升高提取率降低.因此,浸提温度65℃为最佳的工艺参数.

图1 浸提温度对多糖提取率的影响

2.1.2 浸提时间对多糖提取率的影响 浸提时间单因素对多糖提取率的影响如图2.由结果可得：在0.5-1.5h之间,提取率增幅较大,在1.5h之后增幅较小且不规律,在1.5h处和3h处各出现一个峰值,在3h处达最大值.因此,浸提时间3h为最佳.

图2 浸提时间对多糖提取率的影响

2.1.3 料液比对多糖提取率的影响 其结果如图3：料液比对多糖提取率的影响较大,在1∶15处提取率最高.因此,料水比1∶15为最佳.

图3 料液比对多糖提取率的影响

2.1.4 乙醇浓度对多糖提取率的影响 其结果如图4：乙醇浓度对多糖的提取率影响较小,但在95%的乙醇浓度下提取率明显高于其他浓度.因此,乙醇浓度95%为最佳.

图4 乙醇浓度对多糖提取率的影响

2.2 正交试验

根据单因素实验结果,选取浸提时间,浸提温度,浸提料液比,沉淀乙醇浓度为正交试验的影响因素,进行正交试验及数据处理如表2：

表2 L9(34)正交试验及极差分析

由极差分析得出影响主次效果为：A>C>B>D,因此,水浸提苦丁茶多糖提取率的最佳参数为A3B2C1D3,即浸提温度为85℃,乙醇浓度为75%,浸提时间为1.5h，料液比为1∶15.此条件下的多糖提取率为3.53%.

2.3 苦丁茶多糖对红细胞溶血的抑制作用

对照组与试验组经37℃水浴24h后,出现明显的溶血现象,以对照组为100%溶血,计算各处理组溶血度.结果见表3.

表3 苦丁茶多糖对红细胞自溶血的保护作用

注：试验组与对照组比较**P<0.01

由表3可知,对照组溶血度为100%,苦丁茶多糖及Vc个组抑制红细胞自氧化作用比较明显,均为随着浓度的增加溶血度逐渐降低,茶多糖在浓度为200-400μg/mL时,溶血度下降趋势平缓,当浓度大于400μg/mL溶血度迅速下降,抗氧化活性迅速上升,当茶多糖浓度达到600μg/mL与200μg/mL的Vc抗氧化活性相近.Vc所呈现的趋势较为明显，经T检验,茶多糖及Vc各剂量组与对照组比较存在极显著性差异(P<0.01).

2.4 苦丁茶多糖对H2O2所致红细胞溶血的抑制作用

正常组、对照组及实验组于37℃水浴恒温1h后,出现明显的溶血现象,结果见表4.

表4 苦丁茶多糖对H2O2所致红细胞溶血的抑制作用

注：正常组与对照组比较#P<0.05; 试验组与对照组比较**P<0.01

由表4可知，茶多糖各浓度组均可抑制H2O2所致红细胞的溶血.当茶多糖浓度为600μg/mL时,抑制H2O2对红细胞溶血的作用与200μg/mL的Vc相近,浓度越高茶多糖对H2O2所致红细胞的溶血抑制作用也越强.经T检验,茶多糖各剂量组、Vc各组与对照组比较均存在极显著性差异(P<0.01).

3 结论与讨论

本研究采用热水浸提法对海南苦丁茶多糖的提取工艺进行了研究, 由单因素和正交试验得出结论: 影响多糖提取率的主要是温度,其次是浸提时间、乙醇浓度、料液比.正交试验所获得的优化提取工艺条件为：浸提温度为85℃,乙醇浓度为75%,浸提时间为1.5h,料液比为1∶15,多糖得率为3.53%.此法与施思等[13]苦丁茶多糖最大提取率4.71%稍有偏低,分析可能为苦丁茶产地不同使其多糖提取率受影响.黄敏桃等[14]认为，不同产地整体对比中,广西产地>广东产地>海南产地.

在机体内红细胞是一种具有运输O2及CO2作用的细胞,其膜内的血红蛋白使其功能的发挥成为可能,一旦细胞膜发生破坏,其内部的血红蛋白外溢,红细胞被破坏其运输能力便丧失[15].由于红细胞膜易受到氧自由基的攻击而使红细胞膜的完整性发生破坏,导致溶血.H2O2是一种强氧化剂,可以破坏红细胞,导致红细胞破裂红蛋白溢出,茶多糖可以明显抑制H2O2的这种作用.Vc是强抗氧化剂,在试验中作为标准对照,将茶多糖的抗氧化活性与之比较可以达到显著对比效果.陈朝银等[16]发现普洱茶多糖的抗氧化性与Vc相近.苦丁茶多糖对红细胞溶血的抑制作用的实验表明,浓度越高与Vc的抗氧化活性越接近.结论：苦丁茶多糖在体外能够明显抑制人血红细胞自氧化溶血作用以及双氧水所致红细胞氧化溶血作用,显示良好的应用价值.

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Extraction Technology of Hainan Kuding Tea Polysaccharides and Its Protective Effects on Erythrocyte Hemolysis

YU Shu-chi，WANG Pei ，XU Lin-lang，WANG Hai-juan，ZHOU Wen-ping

(School of Food Sciences, Qiongzhou University, Sanya Hannan, 572022, China)

Polysaccharides is extracted from Hainan Kuding tea by using the water extraction method with the technology optimized by designing the orthogonal tests. The protective effects of Kuding tea on hemolysis of red blood cells and H2O2induced hemolysis are further studied. The result shows that the order of the elements affecting the extraction rate is temperature>time> ethanol concentration> ratio of material to solvent. The perfect condition for the extraction is Temperature: 85℃, Ethanol Eoncentration: 75%, Time: 1.5h, and Ratio of Material to Solvent: 1∶1.5. Under this condition the extraction ratio of Polysaccharides is 3.53%. Polysaccharides extracted from Hainan Kuding tea has an obvious inhibiting effect on the hemolysis of red blood cells. The inhibiting effect increases with the increase of the density of Polysaccharides. The hemolysis effect declines slowly and steadily when the range of density of Polysaccharides is within 200μg/mL～400μg/mL. But when the density is greater than 400 g/mL, the hemolysis effect declines rapidly and its antioxidant activity increases rapidly. The Vc antioxidant activities possess similar effects when density of Polysaccharides reach 600μg /mL and 200μg/m. Polysaccharides extracted from Hainan Kuding tea has a protective effect on the hemolysis of red blood cells induced by H2O2. The inhibiting effect of the hemolysis of red blood cells also increases with the increase of the density of Polysaccharides. With the same densities, the antioxidant activity of Polysaccharides is weaker than Vc solution.

Kuding tea; tea polysaccharide; orthogonal test; red blood cell haemolysis

2015-04-07

三亚市院地科技合作项目(2015YD42)；琼州学院2014年度实验室开放项目(2014QYKY009)

于淑池(1966-)女，河北省平泉县人，满族，琼州学院食品学院副教授，研究方向为生物活性物质.

R284. 1

A

1008-6722(2015) 05-0050-06

10.13307/j.issn.1008-6722．2015．05．12