不同温度热疗联合多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株增殖的影响

崔宝林，宁晓娥

(陕西省宝鸡市妇幼保健院：1.乳腺科；2.计划生育科 721000)



·论 著·

不同温度热疗联合多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株增殖的影响

崔宝林1，宁晓娥2

(陕西省宝鸡市妇幼保健院：1.乳腺科；2.计划生育科 721000)

目的 探讨亚高温热疗联合多西紫杉醇对人乳腺癌增殖的影响及其相关机制。方法 采取四甲基偶氮唑盐法观察多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖的影响，且筛选出有效浓度。将体外培养的MCF-7细胞分为空白对照组、多西紫杉醇组及热疗与多西紫杉醇联合组，热疗与多西紫杉醇联合组依据不同温度(39.0 ℃、39.5 ℃、40.0 ℃、40.5 ℃、41.0 ℃)分为5个亚组。对各组细胞予以相应干预后，采取流式细胞仪检测各组细胞凋亡状况及细胞生长周期变化。结果 随着热疗温度上升，细胞凋亡比例渐渐增高，41.0 ℃热疗时凋亡率[(38.90±6.88)%]最高，显著高于单一应用多西紫杉醇与其他各亚组；c-Jun氨基末端激酶在热疗温度为41.0 ℃时达到最高值，而细胞外调节蛋白激酶1/2、p-p38蛋白表达在热疗温度为40.0 ℃达到最高值，同其余亚组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；热疗与多西紫杉醇联合等亚组G2/M期细胞比例明显多于单一使用多西紫杉醇组，抑制MCF-7细胞周期进程的效应明显强于多西紫杉醇，且随着热疗温度增加，G2/M期细胞比例增高，差异有统计学意义(P<0.05)。热疗与多西紫杉醇联合组丝裂原活化蛋白激酶通路蛋白表达较多西紫杉醇组显著增强，Bcl-2蛋白表达则明显降低，而Bax蛋白表达有轻微升高。结论 亚高温热疗联合多西紫杉醇干预能抑制人乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有协同抗肿瘤效应，其治疗机制可能与激活细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38蛋白有关。

热疗；多西紫杉醇；乳腺癌

迄今为止，临床治疗乳腺癌的主要方法有手术切除、术后化学治疗、放射治疗、热疗及内分泌治疗等[1]。有报道指出，热疗能够提高化疗药物的细胞毒性，与化学治疗联合应用具有协同抗肿瘤的作用[2-3]。临床上认为，低于41.0 ℃的亚高温热疗主要是经过调理免疫功能而起到抗肿瘤作用，不能够协同化学治疗药物杀灭肿瘤细胞，然而也有报道提出，一些乳腺癌患者在温度为39.0 ℃时，化疗效果比较显著[4]。鉴于此，本研究主要探讨不同温度热疗联合化疗是否对乳腺癌细胞株的增殖产生影响及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株MCF-7由中科院上海生物化学与细胞生物学研究所提供，多西紫杉醇注射液(20毫升/支)由上海复兴医药有限公司提供，胎牛血清、高糖DMEM(DMEM)培养基、兔抗p-细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、ERK 1/2、p-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/SAPK、JNK/SAPK、甘油醛-3-磷酸脱氢酶一抗、四甲基偶氮唑盐、p-p38一抗、鼠抗Bcl-2、Bax一抗均由美国Sigma公司提供，FACSort流式细胞仪由日本Beeton Dickson公司提供。

1.2 乳腺癌细胞培养 在10%浓度小牛血清的DMEM培养基中培养乳腺癌细胞株MCF-7细胞，将培养基置于CO2体积分数为0.05的37.0 ℃培养箱中孵育，选取对数生长期的MCF-7细胞用于试验。

1.3 检测MCF-7细胞的凋亡率 选取对数生长期的MCF-7细胞用于试验，将其分为对照组(不作任何处理)、热疗与多西紫杉醇联合组、多西紫杉醇组，热疗与多西紫杉醇联合组又依据不同热疗温度，将其分为39.0、39.5、40.0、40.5、41.0 ℃等5个亚组，与多西紫杉醇在对应温度的恒温水浴箱中共同作用2 h后，接着培养24 h。收集培养后的细胞，每组细胞以4.0 ℃ 磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，制备成单细胞悬浮液；将细胞浓度调整为每毫升1×106个,另取100 μL细胞悬浮液，加入10 μL PI溶液与5 μL Annexin V/FITC后，充分混匀，避光常温培养15 min，再加入400 μL PBS应用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4 检测MCF-7细胞周期 乳腺癌细胞株MCF-7细胞分组情况及处理方法同上，操作结束后将每组细胞置于CO2体积分数为0.05的37.0 ℃培养箱中培养24 h，以4.0 ℃PBS清洗培养过的细胞后，再经80%乙醇固定，置于-20.0 ℃环境下，隔日再用。用PBS清洗各组固定细胞后，在遮光常温环境下应用PI染色，30 min后再上样，采取Modfit 3软件对每组细胞生长周期状况进行检测。

1.5 多药耐药基因产物P糖蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、Bcl-2、Bax及MCF-7细胞热休克因子检测 各组细胞处理方法同上，结束后应用蛋白裂解缓冲液(含苯甲磺酰氟1 mmol/L、正钒酸钠1 mmol/L、十二烷基磺酸钠0.1%、去氧胆酸钠1%、NP-40.1%、氯化钠150 mmol/L)分别水解每组细胞，获得总蛋白，检测总蛋白浓度，标准品为牛血清蛋白。按照蛋白定量试剂盒说明书拟定蛋白定量标准曲线，采取紫外分光光度计测定吸光度A值(595 nm处)，算出蛋白浓度。将全部蛋白样品的浓度调节成等浓度后，经电泳分离后转至PVDF膜上，密闭后加入一抗，培养后滴加对应过氧化物酶结合的二抗。采用ECL化学发光试剂盒测定杂交信号，分别检测各样品中ERK1/2、JNK、p38及Bcl-2/Bax蛋白表达状况。

2 结 果

2.1 不同温度热疗与多西紫杉醇联合对MCF-7细胞凋亡的影响 见图1。通过显微镜观察MCF-7细胞凋亡状态，细胞发生皱缩，体积变小，变圆，细胞轮廓清晰，细胞透明度减小，呈棕黑色。随着热疗温度上升，细胞凋亡比例渐渐增高，41.0 ℃热疗时凋亡率[(38.90±6.88)%]最高，显著高于单一应用多西紫杉醇与其他各亚组的细胞凋亡率。

注：与对照组相比，aP<0.05；与多西紫杉醇组相比，bP<0.05。

图1 热疗联合多西紫杉醇对MCF-7细胞凋亡的影响

2.2 热疗联合多西紫杉醇对MCF-7细胞生长周期的影响 见表1。热疗与多西紫杉醇联合等亚组G2/M期细胞比例明显多于单一使用多西紫杉醇组，抑制MCF-7细胞周期进程的效应明显强于多西紫杉醇，且随着热疗温度增加，G2/M期细胞比例增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 热疗与多西紫杉醇联合对MCF-7细胞生长周期影响

注：与多西紫杉醇组相比，aP<0.05。

2.3 热疗与多西紫杉醇联合对MCF-7细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响 见图2。热疗与多西紫杉醇联合会导致MCF-7细胞中MAPK p-ERK1/2、p-JNK、p-p38蛋白表达显著增强，其中p-JNK蛋白在热疗温度为41.0 ℃时达最高值，p-ERK1/2、p-p38蛋白表达在热疗温度为40.0 ℃达最高值，同其余亚组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 热疗与多西紫杉醇联合对MCF-7细胞MAPK表达的影响

2.4 MCF-7细胞凋亡蛋白Bax及Bcl-2表达的影响 见图3。MCF-7细胞经过热疗与多西紫杉醇联合应用后，Bax蛋白表达较空白对照组及多西紫杉醇组略有增多，但差异无统计学意义,不同热疗温度亚组组间差异也无统计学意义(P>0.05)。多西紫杉醇可导致MCF-7细胞凋亡蛋白Bcl-2表达减少，热疗与多西紫杉醇联合应用后，细胞内Bcl-2表达较单一应用多西紫杉醇进一步减少，差异有统计学意义(P<0.05)，不同热疗温度亚组组间Bcl-2蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 热疗与多西紫杉醇联合对MCF-7细胞Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨 论

乳腺癌对全球范围内女性健康构成严重威胁，其发病率逐年增加[5]。随着医学研究的持续拓展，广大临床工作者已经接受了乳腺癌为全身性疾病这一理念，治疗方案也发生改变，手术切除不再是仅有的治疗手段，治疗重点由乳腺组织渐渐转至全身，新的分子靶向治疗、内分泌治疗、辅助治疗、热疗及放射治疗等成为医治乳腺癌的重要方法[6-7]。因热疗具有不良反应轻微，且与化疗、放疗联合应用具有协同效应等优势，逐渐得到临床关注。

3.1 不同热疗温度联合多西紫杉醇对乳腺癌细胞株凋亡率的影响 临床上关于热疗治疗肿瘤的有效温度一直都存在很大争议[8]。大量基础研究表明，不论是应用水浴箱加热、红外线辐射，还是微波热疗等加热方式，热疗发挥抗肿瘤作用的有效温度范围为42.0～45.0 ℃[9-11]。由于热疗对治疗设备有较高要求及人体体温限制，42.0～45.0 ℃热疗在临床实践中不能大量应用，而且单一热疗杀灭肿瘤细胞存在局限性，总体治疗效果欠佳。因而近年来，国内外对热疗适宜温度的研究重点主要集中于40.0～41.0 ℃。关于40.0～41.0 ℃热疗有无抗肿瘤效应的临床结论不一致。蒋东等[12]在对肺癌细胞予以加热时，40.0 ℃即可诱导细胞凋亡。Yamada等[13]认为，39.0～41.0 ℃可以进一步激活人体体液免疫及细胞免疫系统，进而提高人体的抗肿瘤免疫功能。

本研究结果显示，41.0 ℃热疗与多西紫杉醇联合组乳腺癌细胞株凋亡率明显高于其他热疗亚组及多西紫杉醇组，说明与单一应用多西紫杉醇相比，热疗与多西紫杉醇联合应用可引起乳腺癌细胞株凋亡增加。提示亚高温热疗(41.0 ℃)联合多西紫杉醇具有协同杀灭肿瘤细胞的作用。且随着热疗温度上升至41.0 ℃,凋亡的细胞数目持续增加。分析可能的原因有:(1)多西紫杉醇对乳腺癌细胞株MCF-7比较敏感，抑制乳腺癌细胞株MCF-7的效用与剂量相关，细胞毒性随浓度提高而增强。(2)热疗温度控制在40.5～43.0 ℃时，多种化疗药物的细胞毒性效应达到最大。(3)MAPKs可经一系列信号传导途径，将胞外刺激传导至细胞内，是细胞内最关键的一条信号传导通路，在肿瘤的发生与发展中有重大意义。有关研究指出，MAPK蛋白在乳腺癌发病机制中也有参与，哺乳动物细胞MAPK蛋白系族中多个成员(如ERK、JNK、p38等)均已证实同乳腺癌紧密相关[14]；MAPK通路被激活以后，ERK、JNK、p38等通路也会随着激活。本研究结果显示，MCF-7细胞经热疗及多西紫杉醇联合处理后，细胞内p-p38、p-JNK及p-ERK1/2蛋白表达均显著增多，其中p38、JNK等通路活化产生的生物作用同细胞凋亡相关，这也可能是热疗与多西紫杉醇联合应用促进肿瘤细胞凋亡作用优于单一应用多西紫杉醇的原因之一。另外，p-p38与p-ERK1/2蛋白表达在热疗温度高于40.0 ℃时开始渐渐下降，具体机制尚不明确。

3.2 不同温度热疗联合多西紫杉醇对乳腺癌细胞株增殖的影响 本研究结果显示，多西紫杉醇能使MCF-7细胞的生长周期停滞于G2/M期，热疗联合多西紫杉醇处理可促进G2期MCF-7细胞数量上升，且滞留在G2期的细胞比例随热疗温度升高而增多。此外，40.0、40.5、41.0 ℃热疗与多西紫杉醇联合等亚组G2/M期细胞比例明显多于单一使用多西紫杉醇组，抑制MCF-7细胞周期进程的效应明显强于多西紫杉醇，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着热疗温度上升至41.0 ℃，G2/M期细胞比例逐渐增加。提示热疗可协同多西紫杉醇引起更多肿瘤细胞生长停滞于G2/M期,进而发挥阻碍肿瘤细胞分裂及增殖的作用。

有研究指出，肿瘤细胞中Bcl-2基因的高表达与肿瘤的发生与发展紧密相关，Bcl-2基因表达缺失或者下调能够提高MCF-7细胞对多西紫杉醇化疗的敏感性，此现象可能与乳腺癌细胞株MCF-7雌激素受体的表达有关[15]。本研究发现，多西紫杉醇可导致MCF-7细胞凋亡蛋白Bcl-2表达减少，热疗与多西紫杉醇联合应用后，细胞内Bcl-2表达较单一应用多西紫杉醇进一步减少，差异有统计学意义(P<0.05)，不同热疗温度亚组组间Bcl-2蛋白表达差异也有统计学意义(P<0.05)。提示热疗与多西紫杉醇联合应用可显著抑制Bcl-2通路，促进细胞凋亡，进而抑制MCF-7细胞增殖。

综上所述，亚高温热疗联合多西紫杉醇干预能抑制人乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有协同抗肿瘤效应，其治疗机制可能与p-ERK、JNK、p38蛋白有关。

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Synergistic effect of docetaxel plus hyperthermia of different temperatures on the proliferation of human breast carcinoma cells

CUIBao-lin1,NINGXiao-e2

(1.DepartmentofGalactophore;2.DepartmentofFamilyPlanning,MaternalandChildHealthHospitalofBaojiCity,Baoji,Shaanxi721000,China)

Objective To explore the synergistic effect of docetaxel plus mild hyperthermia on the proliferation of human breast carcinoma cells and its mechanism.Methods MTT assay was used to test the inhibitory effect of docetaxel on the proliferation of human breast carcinoma MCF-7 cells,and the effective concentration of docetaxel was screened.The human breast carcinoma MCF-7 cells cultured in vitro were divided into blank control group,docetaxel group and docetaxel plus hyperthermia group.The docetaxel plus hyperthermia group was divided into 5 subgroups (39.0 ℃ group,39.5 ℃ group,40.0 ℃ group,40.5 ℃ group and 41.0 ℃ group),according to the different temperatures of hyperthermia.Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis and the change of cell growth cycle in every group after intervention.Results The apoptosis rate of cells increased with the temperature of hyperthermia.41.0 ℃ group had the highest apoptosis rate of cells [(38.90±6.88)%],which was significantly higher than docetaxel group and other subgroups of docetaxel plus hyperthermia group.The activity of c-Jun amino-terminal kinase reached maximum when the hyperthermia temperature was 41.0 ℃,while the activities of ERK1/2 and p-p38 reached maximum when the hyperthermia temperature was 40.0 ℃,which was significantly different from other subgroups of docetaxel plus hyperthermia group(P<0.05).The proportions of cells at G2/M phase in the subgroups of docetaxel plus hyperthermia group were significantly higher than docetaxel group.The inhibitory effect of docetaxel plus hyperthermia on the MCF-7 cell cycle was stronger than docetaxel alone.The proportion of cells at G2/M phase increased with the hyperthermia temperature,with statistical difference(P<0.05).Compared with docetaxel group,the expression level of mitogen activated protein kinase pathway protein in docetaxel plus hyperthermia group was significantly higher,the expression level of Bcl-2 significantly reduced,and the expression level of Bax slightly increased.Conclusion Docetaxel plus hyperthermia could inhibit the proliferation of human breast carcinoma cells and induce the apoptosis,which showed a synergistic antitumor effect.The mechanism might relate with the activation of extracellular regulated protein kinase,c-Jun amino-terminal kinase and p38.

hyperthermia；docetaxel；breast carcinoma

崔宝林，男，本科，主治医师，主要从事乳腺方面相关临床研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.029

A

1672-9455(2015)23-3522-03

2015-03-25

2015-06-12)