食管鳞癌中Klf17蛋白表达及其对Eca109细胞迁移和侵袭能力的影响

王聪懿，张 诚，罗 骏，吴庆琛

(重庆医科大学附属第一医院胸心外科，重庆400010)

食管鳞癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤之一，但其病因和发病机制尚不明确，可能与原癌基因激活、抑癌基因失活相关［1］。KLF17 作为一种转录调控因子与细胞生长、分化、及肿瘤细胞转移等生理或病理过程有着密切关系［2］。本研究意在通过观察食管鳞癌组织中KLF17 蛋白表达与临床病例特征的关系探讨KLF17 在食管鳞癌的发生、发展、转移的作用，以及过表达KLF17 基因对Eca109 细胞迁移、侵袭能力的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病例资料:选取2012年6月至2013年3月重庆医科大学附属第一医院术前未经过放化疗的食管鳞癌患者肿瘤及癌旁(肿瘤外5 cm)新鲜术后组织标本共81 例，进行石蜡包埋切片，其中食管鳞癌组:44 例，男32 例，女12 例，年龄41～79 岁，平均年龄(54.3 ±7.2)岁;癌旁正常组:37 例，男26例，女11 例，年龄41～79 岁，平均年龄(52.8 ±9.3)岁。所有标本均经TNM 分期、分化程度、年龄、性别等归类。所选患者均知情同意。

1.1.2 细胞与慢病毒:Eca109 细胞由重庆医科大学附属第一医院肿瘤实验室保存，在含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养液中常规培养。过表达KLF17的慢病毒载体设计、构建和包装(上海吉凯基因生物公司)。

1.1.3 主要试剂:KLF17 兔抗人多克隆抗体(Abcam 公司);E-cadherin 和N-cadherin 兔抗人多克隆抗体(Cell Signal 公司);总RNA 提取试剂盒、RTPCR 试剂盒及实时荧光定量试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara 公司);BCA 蛋白浓度测定试剂盒、HRP 标记山羊抗兔IgG、细胞裂解液、PMSF、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒和5 × SDSPAGE 蛋白上样缓冲液(碧云天公司);ECL 发光试剂盒(Thermo Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色:切片经二甲苯脱水，梯度乙醇复水，枸橼酸高温抗原修复，3% H2O2阻断，PBS冲洗3 次，分别加入一抗及二抗，DAB 显色，苏木精复染、脱水、透明。以PBS 代替一抗做阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。结果判定:以胞质中染色强度浅黄、棕黄、棕褐色分别评为1、2 和3 分，以染色的细胞比例＜10%、10%～30%、30%～50%和＞50%分别评为0、1、2 和3 分。总体评分值=染色强度×染色细胞比例。评分:≤3 分为阴性表达，4～9 分为阳性表达。

1.2.2 慢病毒的转染与实验分组:用含10%胎牛血清的1640 培养基，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养细胞，当处于对数期增殖时将其传代，以MAI 值0、10、20、30、40、50 和60 时分别加入空载体慢病毒，嘌呤霉素筛选稳定株后，将Eca109 细胞分为3组:CON 组(未进行处理的Eca109 细胞);Ad-GFP组(用空白病毒转染的Eca109 细胞);Ad-KLF17 组(过表达KLF17 慢病毒载体转染的Eca109 细胞)。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测:待细胞呈汇合状态时，分别收集各组细胞，按照说明书提取总RNA，反转录制备cDNA，荧光定量PCR 采用SYBR 说明书10 μL 体系及反应条件。相对基因表达分析采用2－ΔΔCt法，实验重复3 次。

1.2.4 Western blot 检测:裂解细胞后，4 ℃12 000 r/min离心5 min，BCA 法测定蛋白浓度，加SD 上样缓冲液，100 ℃变性10 min，取40 μg 总蛋白，经电泳分离后，电转至PVDF 膜上，将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉的TBST 中室温封闭1 h 后加入一抗，4 ℃孵育过夜，次日TBST 洗涤3 次×10 min，二抗室温孵育2 h，TBST 洗涤3 次×5 min，ECL 发光液发光，X 片压片处理后，扫描。Quantity One 检测吸光度值，以目的蛋白/内参照吸光度值表示。该实验重复3 次。

1.2.5 细胞划痕实验:取对数增殖期的3 组Eca109 细胞，以每105个/孔种于6 孔板的3 孔并标记，待细胞为结合状态时，在6 孔板背面用记号笔划10 根平行线做标记，200 μL 枪头在细胞中间划条垂直于背面平行线的直线，PBS 冲洗2 次，加入2 mL含1%胎牛血清的1640 培养基，细胞的愈合能力用于检测迁移能力。用倒置显微镜分别于0 和48 h观察并拍照，Image J 分别测量细胞迁移距离，取5组随机数据计数。实验重复3 次。

1.2.6 体外Transwell 侵袭实验:Matrigel 与无血清1640 以1∶8 配比100 μL 铺在24 孔板上的小室中，置于37 ℃孵箱6 h。将各组细胞胰蛋白酶消化后，用无血清1640 分别制成5 000 个/100 μL 细胞种于上室，下室加入800 μL 含10%血清的1640，孵育24 h 后，PBS 清洗3 次，甲醇室温固定30 min，自然风干，每孔加入0.25%结晶紫溶液染色10～15 min，PBS 清洗3次，棉球小心将上层小室内细胞擦净，显微镜下观察侵袭的细胞数目，取5 个视野计数，实验重复3 次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行统计处理，数据以均数±标准差(±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用配对t 检验。

2 结果

2.1 KLF17 蛋白表达与临床病理特征的关系

KLF17 蛋白表达在肿瘤组织中明显低于癌旁正常组织(P＜0.05)(表1，图1)。与肿瘤侵袭深度、淋巴结转移及TNM 分期显著相关(P＜0.05)(表2)。

表1 KLF17 在44 例食管鳞癌组织及37 例癌旁组织的表达差异Table 1 Different expression of KLF17 in 44 esophageal squamous cell carcinoma tissues and 37 paracarcinoma tissues

2.2 慢病毒对Eca109 细胞转染效率

MAI 为0、10、20、30、40、50 和60 时，96 h 感染效率分别为0%、10%、30%、50%、80%、＞95%和＞99%。当MAI 值为50 时，转染效率高，细胞状态较好，故选择MAI 值50 转染细胞进行后续实验。

图1 食管癌及癌旁组织中KLF17 的表达Fig 1 Expression of KLF17 in esophageal cancer tissues and that of adjacent to carcinoma(×200)

表2 KLF17 在肿瘤组织中的表达与临床病理资料的数据统计Table 2 Data statistics of clinicopathologic data and expression of KLF17 in tumor tissue

2.3 慢病毒对Eca109 细胞中KLF17 mRNA、蛋白表达的影响

Ad-KLF17 组KLF17 mRNA 表达明显高于对照组及Ad-GFP 组，KLF17 蛋白Ad-KLF17 组表达明显高于对照组及Ad-GFP 组(P＜0.05)(图2，表3)。

图2 病毒转染后各组细胞KLF17 蛋白的表达Fig 2 Expression of KLF17 protein in lentivirus group of cells after transfection

2.4 KLF17 抑制Eca109 细胞的迁移能力

Ad-KLF17 组细胞划痕48 h 后迁移距离为(137.2 ±8.2)μm，对照组为(221.4 ±25.9)μm，Ad-GFP 组为(228.6 ±22.5)μm。Ad-KLF17 组细胞迁移距离明显比对照组和Ad-GFP 组短(P＜0.05)(图3)。

表3 各组细胞KLF17 mRNA 及蛋白表达量Table 3 Expression index of KLF17 mRNA and protein in groups of cells(±s，n=3)

表3 各组细胞KLF17 mRNA 及蛋白表达量Table 3 Expression index of KLF17 mRNA and protein in groups of cells(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with control group.

groupKLF17 mRNAKLF17 protein CON1.354 ±0.2230.155 ±0.008 Ad-GFP1.000 ±0.1830.158 ±0.011 Ad-KLF1711.229 ±1.909*1.095 ±0.077*

2.5 KLF17 抑制Eca109 细胞的侵袭能力

Ad-KLF17 组侵袭24 h 穿过小孔的细胞数为(27 ±3)个，显著低于对照组(58±5)个、Ad-GFP 组(54±4)个(P＜0.05)，Ad-KLF17 组穿过小孔的细胞数明显比两个对照组少(P＜0.05)(图4)。

2.6 慢病毒对Eca109 细胞中E-cadherin 及Ncadherin 蛋白表达的影响

Ad-KLF17 组E-cadherin 表达明显高于对照组及Ad-GFP 组，Ad-KLF17 组N-cadherin 蛋白表达明显低于对照组及Ad-GFP 组(P＜0.05)(图5，表4)。

3 讨论

KLF 家族属于锌指蛋白家族，它们均对细胞的侵袭和增殖起重要作用［3-4］。低表达KLF17 的乳腺癌、肝癌细胞迁移侵袭能力明显增强，并加速上皮向间质转化，KLF17 表达的缺失对上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生发展起着重要的作用［5-7］。EMT 通过抑制肿瘤细胞的稳定性、改变肿瘤细胞活动性、增强肿瘤细胞侵袭力等来影响肿瘤细胞的生物学特征［8］。近年，在上皮组织及间质组织中发现了许多标志性的基因［9］，N-cadherin 和E-cadherin 为其中两个有代表性的标志物。N-cadherin 能使肿瘤细胞之间的黏附力下降，可增加细胞的迁移和侵袭能力［10］。E-cadherin 下调能伴随N-cadherin 上调，引起细胞的稳定性下降，使细胞之间的连接能力下降［11］。

图3 划痕实验48 h 后各组细胞的迁移情况Fig 3 The migration of each group of cells after 48 hours scarification test(×100)

图4 Transwell 侵袭实验各组细胞24 h 穿过小室的细胞数Fig 4 Comparison of passing cell numbers in 24 hours Transwell invasion assay(×200)

图5 慢病毒转染后各组细胞E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表达Fig 5 The protein expression of E-cadherin and N-cadherin after lentivirus transfection

表4 各组细胞E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表达量Table 4 Expression index of E-cadherin and N-cadherin protein in groups of cells(±s，n=3)

表4 各组细胞E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表达量Table 4 Expression index of E-cadherin and N-cadherin protein in groups of cells(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with control and Ad-GFP group.

groupE-cadherinN-cadherin CON0.252 ±0.0330.242 ±0.020 Ad-GFP0.273 ±0.0150.228 ±0.020 Ad-KLF170.447 ±0.020*0.111 ±0.014*

本实验发现，KLF17 在食管鳞癌中的表达明显低于癌旁正常组织的表达(P＜0.05)。KLF17 的表达与肿瘤侵袭深度、淋巴结转移情况、TNM 分期呈负相关。KLF17 对于食管鳞癌的迁移、侵袭等作用可能存在着抑制作用。过表达KLF17 后，E-cadherin 蛋白明显增高，而N-cadherin 明显降低。细胞划痕迁移距离明显缩短，细胞穿过Transwell 膜小孔的数目也明显减少。这些提示KLF17 上调后Eca109细胞的迁移和侵袭能力明显下降，Eca109 细胞上皮-间质转化作用可能随之减弱。

综上所述，本研究发现KLF17 的蛋白表达与食管鳞癌病理资料密切相关，对食管鳞癌发生发展起重要作用，KLF17 对Eca109 细胞发生EMT 转化可能发挥着重要作用，为临床运用推广提供一定的理论基础。

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