骨桥蛋白对RANKL诱导破骨细胞分化的影响

王增田，邢 杰，李 覃

骨桥蛋白对RANKL诱导破骨细胞分化的影响

王增田1，邢 杰2，李 覃2

目的 初步探讨骨桥蛋白对破骨细胞体外分化的影响。方法 体外培养小鼠破骨前体RAW264.7细胞，RANKL诱导刺激其分化为破骨细胞，并加入骨桥蛋白进行干预。MTT法及TRAP染色分别检测破骨细胞细胞增殖及前体破骨细胞分化情况，RT-PCR检测RANK的mRNA表达水平。结果 骨桥蛋白可明显促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化、增加细胞增殖，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，并使破骨细胞特征性基因RANK的mRNA表达上调约2.67倍。结论 骨桥蛋白可能通过影响RANK/RANKL信号通路促进RAW264.7细胞分化为破骨细胞，有望成为防治骨质疏松等骨相关疾病的新靶点。

骨桥蛋白；RAW264.7细胞；破骨细胞；细胞分化

骨正常代谢主要以骨重建形式进行，在激素、细胞因子等协同作用下，骨组织吸收旧骨、生成新骨，其中破骨细胞介导骨吸收功能，成骨细胞介导骨形成功能，通常情况维持一种动态平衡[1]。如果骨重建能力减弱，微损伤产生速度大于修复速度导致微损伤积累，则容易发生骨折、骨质疏松、代谢性骨病等骨相关疾病，其中破骨细胞参与的骨吸收功能发挥重要作用。

骨桥蛋白是一种富含丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的分泌型糖蛋白，可介导骨细胞与骨基质的连接，广泛参与多种骨相关疾病的发生发展及骨重塑过程[2]。近年研究显示，骨桥蛋白能够促进破骨细胞与骨基质的黏附并提高破骨细胞的溶骨活性，介导机械应力引起的骨代谢变化，从而在代谢性骨病的发生发展过程中发挥重要作用，但相关理论尚存争议，具体机制仍未阐明。因此，本研究以目前较为公认的破骨前体细胞RAW264.7为研究对象，用核因子 Kappa B受体活化因子配体(receptor activator of nuclear kappa B ligand，RANKL)/巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)诱导获得成熟破骨细胞[3]，体外观察骨桥蛋白对破骨细胞增殖分化的影响，为骨代谢疾病等骨相关疾病的临床诊断和新型防治策略的制定提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠破骨细胞前体细胞RAW264.7由南开大学生命科学学院韩际宏教授惠赠，引自ATCC。DMEM、α-MEM 培养液、胎牛血清(FCS)购于Gibco公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、骨桥蛋白购自Sigma公司；抗酒石酸酸性磷酸酯酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染液试剂盒购自南京凯基生物；RANKL、M-CSF购自Peprotech公司；TRizol试剂购于Invitrogen公司；反转录试剂盒及RT-PCR相关试剂购于天根生化科技有限公司；其他均为国产分析纯。

1.2 破骨细胞体外诱导分化模型的建立 取对数生长期RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1.5×104/ml，置于24孔细胞培养板，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，以含有100 ng/ml RANKL、100 ng/ml M-CSF的α-MEM 完全培养液(含10%FBS、100 U/ml青霉素-链霉素)体外诱导破骨细胞生成，隔2 d换液，持续7 d，倒置相差显微镜观察细胞形态特征的变化。

1.3 TRAP染色 取RANKL/M-CSF诱导7 d后的RAW264.7细胞，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，按试剂盒说明书操作步骤进行TRAP染色。随机选取5个视野/孔，倒置显微镜下观察，计算TRAP染色阳性细胞数(细胞核≥3个，胞质出现棕褐色颗粒)，计数平均值。

1.4 MTT法检测细胞增殖 将上述生长状态良好的RAW264.7细胞更换无血清培养液，24 h后以每孔5×104/ml的细胞密度接种于96孔培养板，给予骨桥蛋白(100 ng/ml)刺激，同时设对照组及空白调零组(含等量细胞培养液)，5复孔/组。继续培养24 h，参照文献[4]，MTT法检测破骨细胞的细胞增殖情况。于490 nm波长检测各孔光吸收度(optical density，OD)。

1.5 RT-PCR RAW264.7细胞按前述步骤诱导分化，并加入骨桥蛋白(100 ng/ml)进行干预。收集各组细胞，按照试剂说明书Trizol法提取细胞RNA，检测A260/A280比值为1.8～2.0。引物序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。RANK(PCR 产物为351 bp)：上游引物，5′-AAGATGGTTCCAGAAGACGGT-3′；下游引物，5′-CATAGAGTCAGTTCTGCTCGGA-3′。GAPDH (225 bp)： 上游引物，5′- TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′；下游引物，5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3′。 按照Promega公司反转录试剂盒说明进行cDNA合成。PCR扩增条件为：预变性94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，34个循环。经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，GAPDH作为内参照，Gel-Doc2000凝胶成像分析系统测定各组条带，计算各组样本目标片段的相对表达量。

2 结 果

2.1 形态学观察 RAW264.7细胞经RANKL/M-CSF诱导后第3天，可见少量细胞核数量增为2～3个，第7天细胞数量明显增多，体积增大，可见片状伪足，几个到几十个细胞核，胞浆内出现大小不等空泡，TRAP染色显示多核细胞，呈淡红色，阳性颗粒核周红色颗粒可掩盖胞核，周边有伪足伸展，骨桥蛋白干预后能显著增加破骨细胞数量(图1)。

2.2 骨桥蛋白对细胞增殖的影响 细胞增殖结果可见，与对照组相比，骨桥蛋白干预24 h后明显促进细胞增殖，OD值从0.33±0.05增加到0.49±0.08 (P<0.05)。

2.3 骨桥蛋白对RANK基因表达的影响 RT-PCR检测结果显示，经RANKL/M-CSF诱导后RAW264.7细胞表面RANK的mRNA表达上调， 骨桥蛋白作用后RANK基因表达进一步增强，其相对表达水平增加约2.67倍(P<0.01)。

3 讨 论

近年来，随着军事训练改革逐渐深化、武警部队遂行任务多样拓展，不断增加的军事训练伤严重影响部队官兵的训练效率。其中，因破骨细胞活性或数量改变导致骨重建失衡而引起的一系列骨相关疾病(如骨质疏松症、炎性反应性骨丢失等)，已成为困扰官兵身心健康重要疾病类型。破骨细胞是来源于骨髓造血干细胞终末分化的多核巨细胞，在病理性骨破坏和生理性骨重建过程中均发挥重要作用[5]。由于成年后机体骨骼基本保持原有形态，使得破骨细胞成了影响骨骼病变的主要因素。因此，探索靶向破骨细胞、调控破骨细胞分化的方法可能从根本上治疗骨质疏松、代谢性骨病等骨相关疾病，也是当前军事医学研究的一个热点方向。

骨桥蛋白是由成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、造血细胞和血管平滑肌细胞等多种组织细胞合成和分泌的多功能糖蛋白[6]，在多种骨相关疾病的致病机制中起重要的调节作用。有报道显示，骨桥蛋白位于RANK下游，可与破骨细胞表面αvβ3整合素结合参与调节破骨细胞介导的骨吸收，并能够使前体破骨细胞迁移到骨表面，进而与整合素结合增强骨吸收，骨桥蛋白基因敲除或骨桥蛋白缺乏时，破骨细胞 数量明显减少，RANKL和M-CSF亦不能诱导产生破骨细胞或促进破骨细胞增殖[7,8]，提示骨桥蛋白可能参与调控破骨细胞的细胞分化并影响其功能活性。本研究TRAP染色及MTT检测结果发现，破骨前体细胞RAW264.7经RANKL/M-CSF诱导可成功分化为成熟破骨细胞，加入骨桥蛋白能够进一步促进RAW264.7分化为破骨细胞，增加破骨细胞生长增殖。

现已明确，破骨细胞分化因子RANKL与其配体RANK及骨保护素OPG介导的信号调节系统是调控破骨细胞分化、活化和凋亡的重要信号系统，可通过级联反应促进前体破骨细胞分化为破骨细胞，如果RANK 减少则使RANKL结合受损，导致破骨细胞分化、成熟受限，骨吸收功能下降[9]。因此，研究人员在体外实验中多采用RAW264.7细胞作为破骨细胞前体细胞，以RANKL 的受体RANK进行诱导，同时加入C-MSF增加RANK 表达，使RANKL与RANK 结合，促进单核细胞聚集形成多核的成熟破骨细胞[10,11]。笔者发现，RAW264.7细胞经RANKL/M-CSF诱导后RANK的基因表达水平明显增强，加入骨桥蛋白能够进一步上调细胞中RANK的mRNA表达，经由RANKL/RANK 的信号传递，使破骨细胞 前体细胞融合，并分化成熟形成破骨细胞，增加破骨细胞增殖。

综上所述，本研究中RANKL联合M-CSF能够诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化，在此过程中加入骨桥蛋白进行干预，能够明显促进破骨前体细胞RAW264.7形成破骨细胞，促进破骨细胞增殖，上调破骨细胞特征性基因TRAP的mRNA表达，在骨代谢平衡的维持中发挥重要作用，以此为靶点进一步深入研究，有望为代谢性骨病等骨相关疾病的防治提供新策略。

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(2015-09-01收稿 2015-10-10修回)

(责任编辑 岳建华)

Effect of osteopontin on differentiation of osteoclasts induced by RANKL

WANG Zengtian1, XING Jie2, and LI Tan2.

1. Department of Clinical Medicine, 2. Department of Pathogen Biology and Immunology, Logistics University of the Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China

Objective To study the effect of osteopontin (OPN) on differentiation of osteoclasts (OC) by RANKLinvitro. Methods Mouse osteoclasts precursor cell line RAW264.7 was cultured and induced to form OC, and was added with osteopontin (OPN). Then, the proliferation and differentiation of OC were detected by MTT assay and TRAP staining. Furthermore, RT-PCR was used to measure the gene expression of RANK. Results The model of OCinvitrowas established successfully, accompanied by the significant increase of proliferation and differentiation of OC (P<0.05). Meanwhile, OPN promoted the expression of RANK mRNA in OC obviously, which could be increased 2.67 times. Conclusions OPN affects the differentiation of RAW264.7 cells to form OC via RANK/ RANKL pathway, which may provide a new target for the prevention and treatment of osteoporosis and bone-related diseases.

osteopontin; RAW264.7 cells; osteoclasts; differentiation

国家自然科学基金(81202843)，天津市应用基础与前沿技术研究计划(14JCZDJC36700)，武警后勤学院科研基金项目(WHJ201405)

王增田，本科学历，副教授，E-mail: wzt022@126.com

300309 天津，武警后勤学院：1.临床医学系，2．病原生物与免疫学教研室

李 覃，E-mail: tanli20042001@163.com

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