DLL4及HIF-1α在乳癌组织表达及意义

郎志强，吴艳秋，郝俊梅，封小丽，潘旭波

(青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院病理科，山东 烟台 264000)



DLL4及HIF-1α在乳癌组织表达及意义

郎志强，吴艳秋，郝俊梅，封小丽，潘旭波

(青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院病理科，山东 烟台 264000)

目的 探讨Delta样配体4(DLL4)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)在乳癌组织的表达及其临床意义。方法 采用免疫组化方法，检测122例乳房浸润性导管癌(其中Ⅰ级33例,Ⅱ级40例,Ⅲ级49例)组织中DLL4和HIF-1α的表达，分析两者表达与乳癌临床病理参数的相关性。结果 DLL4和HIF-1α在乳房浸润性导管癌低级别组(Ⅰ级、Ⅱ级)和高级别组(Ⅲ级)中的表达阳性率分别为63.0%、91.8%和56.2%、89.8%，差异有统计学意义(χ2=12.852、15.695，P<0.05)，但HIF-1α在Ⅰ级和Ⅱ级间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。DLL4在乳癌组织中的表达与组织学分级、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移有关(χ2=4.802～12.852，P<0.05)，与病人年龄、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、HER2表达无相关性(P>0.05)。HIF-1α在乳癌组织中的表达与组织学分级和淋巴结转移相关(χ2=8.961、15.695，P<0.05)，与病人年龄、肿瘤大小、ER、PR、HER2表达无关(P>0.05)。乳癌DLL4阳性表达病人HIF-1α表达阳性率明显高于DLL4阴性表达病人，两者表达水平呈正相关(r=0.270,P<0.01)。结论DLL4和HIF-1α可能共同调控乳癌肿瘤血管生成并影响乳癌的发展及预后，可作为预测乳癌预后的重要参考指标。

乳房肿瘤；Delta样配体4；缺氧诱导因子1；免疫组织化学

血管生成是肿瘤生长的重要因素，与肿瘤的演进、转移密切相关，并影响病人预后，抗血管生成一直是肿瘤治疗的热点，尤其是抗血管内皮生长因子(VEGF)疗法已成为重要的靶向治疗手段[1]。但有研究结果显示，最初对VEGF抑制剂治疗有效的病人在后期的治疗过程中出现耐药现象，另有部分病人对该抑制剂不敏感，因此需寻找新的抗血管生成治疗靶点[2]。近年来的研究结果已显示，表达于血管内皮细胞的Notch配体Delta样配体4(DLL4)在血管生成过程中起重要作用，DLL4和Notch相互作用可调节内皮细胞出芽和分支，进而形成有功能的血管床，抑制DLL4功能或阻断DLL4信号通路，可影响肿瘤血管生成、促进非功能性血管生成，进而抑制移植瘤的生长，因此DLL4有可能成为肿瘤抗血管治疗的新靶点[3-4]。DLL4表达可以受多种上游因子的调控及影响。已有研究结果显示，DLL4不但接受内皮细胞中低氧诱导因子1α(HIF-1α)产生的信号，而且也对HIF-1α-VEGF信号通路起反应[5-6]，但目前DLL4在人实体性肿瘤中的研究尚不充分。本研究通过检测DLL4和HIF-1α在乳房浸润性导管癌(IDC)组织中的表达，探讨两者的相关性及意义。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1标本及其来源

选取我科2008年1月—2009年12月间存档石蜡包埋乳癌组织标本122例，由两名有经验的病理医师按照世界卫生组织(WHO)2003年标准进行组织学分级，其中IDC Ⅰ级33例，Ⅱ级40例，Ⅲ级49例。所有病例均为女性，年龄35～74 岁，中位年龄52岁。

1.2免疫组化染色方法

试剂：DLL4兔抗人多克隆抗体购自Abcam公司；其余抗体购自北京中杉生物公司，其中HIF-1α为兔抗人单克隆抗体(克隆号：EP118)，其余抗体均为鼠抗人单克隆抗体。免疫组化染色采用Envision二步法，使用罗氏公司BENCHMARK®XT全自动免疫组化机进行，经DAB显色、苏木精复染后，脱水、透明、中性树胶封片。用已知阳性标本做阳性对照，PBS替代一抗做阴性对照。

1.3结果判断

DLL4阳性染色表达于细胞质,呈棕黄色颗粒状；HIF-1α阳性染色表达于细胞核，呈棕黄色。按文献的方法[5],根据阳性细胞数占细胞总数的百分率及染色强度来判断DLL4和HIF-1α阳性程度。雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)阳性染色定位于细胞核，HER2阳性染色定位于细胞膜，均呈棕黄色，以阳性细胞百分率≥10%为阳性。

2 结 果

2.1DLL4和HIF-1α表达与乳癌临床病理特征间的关系

乳癌组织DLL4和HIF-1α表达阳性率分别为74.6%和69.7%，二者在低级别组(Ⅰ级、Ⅱ级)和高级别组(Ⅲ级)乳癌组织表达阳性率分别为63.0%、91.8% 和56.2%、89.8%，差异有统计学意义(χ2=12.852、15.695，P<0.05)，但HIF-1α在Ⅰ级和Ⅱ级间的表达差异无显著意义(χ2=0.064，P>0.05)。DLL4在乳癌组织的表达与组织学分级、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移有关(χ2=4.802～12.852，P<0.05)，与病人年龄及ER、PR、HER2表达无关(χ2=0.261～3.724，P>0.05)。HIF-1α在乳癌组织中的表达与组织学分级和淋巴结转移相关(χ2=8.961、15.695，P<0.05)，而与病人年龄、肿瘤大小及ER、PR、HER2表达无关(χ2=0.304～4.407，P>0.05)。见表1。

2.2乳癌DLL4和HIF-1α表达的相关性

乳癌DLL4阳性表达病人HIF-1α的表达阳性率明显高于DLL4阴性表达病人，两者表达水平呈正相关(r=0.270,P<0.01)。见表2。

表1 DLL4和HIF-1α表达与乳癌临床病理特征关系(例)

表2 乳癌DLL4和HIF-1α表达的相关性(例)

3 讨 论

肿瘤的生长和转移依赖血管生成。因此，抗血管生成疗法是目前肿瘤治疗的重要途径之一，尤其是抗VEGF疗法已在部分实体性肿瘤治疗中得到有效应用，然而耐药现象的发生需要寻找新的治疗靶点。Notch配体DLL4是近来发现的影响血管生成的重要因子，在生理性及病理性血管生成过程中起重要调节作用，其表达水平可能与肿瘤对抗血管生成药物的敏感性相关。深入研究DLL4在肿瘤中的表达有助于进行针对性的临床药物试验。

低氧在实体性肿瘤中是常见的，肿瘤细胞通过增加新生血管形成来适应低氧环境。在众多的血管生成相关基因中，VEGF是目前研究最充分的基因之一，已经有抗VEGF的药物应用于临床。另一种重要的肿瘤细胞低氧调节因子是HIF-1，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成，后者表达稳定，对氧浓度变化不起反应；前者表达广泛，是多种细胞中微环境氧平衡的关键调节因子，在低氧环境下可迅速积聚，并反式激活数百种基因，包括血管生成促进因子VEGF。研究显示，HIF-1α在多种病理生理过程中起重要作用，也可表达于肿瘤细胞，通过调节多种靶基因的活性影响肿瘤的生长、血管生成及病人的预后[7-8]。而有关HIF-1α和血管生成负性调节因子DLL4相关性研究较少。脉络膜新生血管相关研究显示，诱导HIF-1α RNA沉默可引起DLL4和VEGF表达上调的停止，而提高VEGF的表达会导致DLL4的表达增高，说明DLL4作为下游因子，既可接受低氧的直接诱导，又接受上游因子VEGF的直接调节[6]。本研究结果显示，DLL4和HIF-1α在高级别乳癌组织表达高于低级别乳癌，两者表达呈正相关，提示在乳癌DLL4可能通过HIF-1α接受低氧的调节。

目前，有关HIF-1α在乳癌组织表达研究结果并不一致。CHEN等[9]研究显示，HIF-1α在导管上皮非典型增生、导管原位癌和IDC中的表达阳性率分别为77.3%、81.8%和78.0%，在不同分级IDC组织表达阳性率差异无统计学意义，在淋巴结阴性组和阳性组的表达阳性率差异也无显著性。VAN DER GROEP等[10]研究结果显示，HIF-1α在遗传性乳癌组织表达阳性率为90%(27/30)，与组织学分级无关；而在散发性乳癌组织表达阳性率为44%(88/200)，其表达随组织学分级的增高而增加，提示HIF-1α在遗传性乳癌血管生成中起重要的调节作用[10]。OKADA等[11]研究HIF-1α在非浸润性乳癌和IDC组织表达，结果显示，HIF-1α在两种病变的表达阳性率分别为40%和44%， HIF-1α在IDC组织表达与VEGF的表达相关。各研究结果不相同的原因可能与阳性标准不同、样本量差异及样本临床分期不同有关。本实验采用与国外大多数研究者一致的标准，即以HIF-1α阳性细胞>1%为阳性，结果显示，HIF-1α在IDC组织总体表达阳性率为69.7%，尽管在Ⅰ级和Ⅱ级IDC组织表达阳性率差异无显著性，但在高级别IDC(Ⅲ级)组织表达明显高于低级别(IDC Ⅰ、Ⅱ级)，差异有显著意义，提示HIF-1α表达与乳癌侵袭性密切相关。本实验结果显示，人乳癌组织HIF-1α表达和淋巴结转移有相关性，提示其在预测病人预后方面有一定价值。

综上所述，DLL4和HIF-1α在高级别乳癌组织阳性表达较低级别者高，且与淋巴结转移状态相关，两者表达呈正相关，提示两者在乳癌组织肿瘤性血管生成过程中起协同作用，可作为预测乳癌预后的重要参考指标。

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(本文编辑 黄建乡)

EXPRESSION OF DLL4 AND HIF-1α IN BREAST CANCER AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE

LANGZhiqiang,WUYanqiu,HAOJunmei,FENGXiaoli,PANXubo

(Department of Pathology, Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, China)

ObjectiveTo explore the expression of Delta-like Ligand 4 (DLL4) and hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) in breast cancer and its clinical significance.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect the expression of DLL4 and HIF-1α in 122 cases of infiltrating duct cancer of the breast-gradeⅠ33 cases, gradeⅡ,40, and grade Ⅲ,49. The correlation between the two expressions with clinicopathologic parameters was analyzed.ResultsThe positive rate of DLL4 and HIF-1α in the low-grade (grade Ⅰ and Ⅱ) cancer group was 63.0% and 91.8%, respectively, and that in the high-grade cancer group was 56.2% and 89.8%, the differences being statistically significant (χ2=12.852,15.695;P<0.05). While the difference of HIF-1α expression between the grade Ⅰand gradeⅡ group was not significant (P>0.05). The expression of DLL4 in the breast cancer was associated with histological grade, tumor size, clinical stage and lymph node metastasis (χ2=4.802-12.852,P<0.05), and unrelated with patient age, ER,PR and HER2 expression (P>0.05). The expression of HIF-1α in patients with positive DLL4 was significantly higher than in those with negative DLL4 (χ2=8.961,15.695;P<0.05), the two expressions were positively correlated (r=0.270,P<0.01).ConclusionDLL4 and HIF-1α are likely to co-regulate angiogenesis of the breast cancer and affect the development and prognosis of this malignancy, which can be used as an important reference mark for predicting its prognosis.

breast neoplasms; Delta-like Ligand 4; hypoxia-inducible factor 1; immunohistochemistry

R737.9

A

1008-0341(2015)01-0004-03