曼氏裂头蚴病诊断方法及其在蛇蛙的应用研究进展

杨光大，肖嘉杰，龚世平，王付民＊，魏玉峰

（1.广东省野生动物救护中心，广东广州510520；2.广东省昆虫研究所，广东广州510260；3.广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东广州510260）

曼氏裂头蚴（Plerocercoid）为曼氏迭宫绦虫（Spirometramansoni）的幼虫阶段，是原尾蚴随受感染蝌蚪发育而成，具较强的感染性和致病性，可侵入人体引起危害严重的曼氏裂头蚴病（Sparganosis mansoni）。该病广泛流行于东亚和东南亚地区，在欧洲、美洲和非洲也有报道［1］。在我国已有数千例报告，其中广东省报道的病例最多，占全国的10%左右［2］。近年来，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、金标免疫渗滤技术（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和免疫印迹（Western blot）技术已逐渐应用于人体曼氏裂头蚴病的诊断，并建立了明确的卫生学诊断标准［3］。然而，在蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断方面，类似快速诊断技术近乎空白，更无商品化检测试剂盒的推出。蛇蛙是曼氏迭宫绦虫重要的第二中间宿主和转续宿主，在人曼氏裂头蚴病感染上有着重要作用［2］；此外，蛇蛙曼氏裂头蚴病可严重影响蛇蛙的生长和繁殖，对食用蛇蛙养殖产业的标准化、规模化和无公害发展具有重要影响。因此，论文针对近年来曼氏裂头蚴病诊断方法的研究现状进行综述，期望对蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断技术的研究提供参考。

1 曼氏裂头蚴病的诊断

1.1 病原学诊断

病原学检查是曼氏裂头蚴诊断的金标准［4］。在人体临床诊断中，通常采用活体组织检查方法来获得虫体，进而通过形态学观察来判定是否为裂头蚴感染［5］。迄今为止，已明确的曼氏裂头蚴虫体基本形态学特征为：呈长带形，乳白色或淡黄色，长0.5 cm～30cm，宽0.3cm～1cm；虫体不分节，但有不规则橫皱褶，体前端无吸槽；虫体的顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，向后延伸一定距离后形成盲管［3］。曼氏裂头蚴病组织病理切片的组织学和免疫组化鉴定是病原学诊断另一重要手段，对虫体不完整或形态学鉴定较为困难的虫体标本具有重要的应用价值［4］。组织病理切片观察曼氏裂头蚴具有四大鉴定特征：体壁皱褶、密集的体毛、体腔内的石灰小体和较细的肌束，这些特征会因为取样切取部位不同而略有差异［4，6］。另外，曼氏裂头蚴可以在人体内不断迁移，在某些部位造成组织炎症与肉芽肿反应，虫体感染周围组织的病理学特征也常作为病原学检查的依据［6］。在人体中，寄生于深部组织或中枢神经系统等部位的虫体不易发现病灶，漏检率高，误诊性大，故病原学诊断方法的局限性也较大［4］。

1.2 影像学诊断

近年来电子计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等技术越来越多应用于曼氏裂头蚴病的鉴别诊断，特别是人体中枢神经系统裂头蚴病［3，7］。目前，已成熟或明确的影像学方法有两种：（1）CT检查［3］。CT检查脑曼氏裂头蚴病具有以下影像学特征：①白质区不规则的低密度占位灶，反映白质退行性病变；②点状钙化灶；③病灶结节状或不规则增强，可能出现感染肉芽肿。（2）MRI检查［7］。MRI也多应用于脑裂头蚴病的临床诊断，其影像学特征为：①CT上白质区不规则、不均匀的低密度占位灶，MRI上表现为T1W低信号，T2W高信号，邻近脑室可有扩大，即所谓负效应；②点状钙化影；③病灶点状增强或迂曲的线条状增强或串珠状增强影；④反复检查发现病灶迁徙性。但CT和MRI检查多用于寄生于深部组织或中枢神经系统等部位的虫体的辅助诊断，且需要多次检查进行比较和鉴别诊断，比较费时费力，也有一定局限性［7］。

1.3 血清免疫学诊断

血清免疫学诊断方法具有创伤小、敏感性高、特异性强和简便经济的优点，已广泛应用于人体曼氏裂头蚴病诊断中，对轻度感染、早期感染、隐性感染和深部组织寄生的病例，是一种良好的检查手段，可弥补病原学和影像学诊断的不足［3，8-9］。目前，国内市场上已有多种基于人体血清中特异性抗体IgY或IgM的试剂盒［10］。近年来，国内外已建立数十种血清免疫学诊断方法，其中3种已列入卫生学诊断标准［3］：①酶联免疫吸附试验（ELISA）。该方法以曼氏裂头蚴排泄-分泌抗原（excretory-secretory，ES）作为诊断抗原，通过间接ELISA方法检测病人血清中虫体特异性IgG抗体，具有高度的敏感性和特异性，稳定性和重复性良好，易于大范围推广。但该方法尚不能完全消除与其他寄生虫病的交叉性反应［3，8］；②斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。该方法将曼氏裂头蚴可溶性抗原点样于硝酸纤维素膜上，以胶体金-SPA为检测标记物，采用垂直流渗滤装置检测病人血清中特异性IgG抗体。该方法操作简单，不需特殊设备，但所用抗原为虫体粗抗原，与其他寄生虫病存在明显的交叉反应，仅适用于疑似病例的初筛或辅助检查［3］；③免疫印迹。该方法以曼氏裂头蚴ES抗原作为诊断抗原，进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并制备抗原膜，再进行免疫学检测，当分子质量36ku和29ku抗原带出现阳性反应时判定为阳性结果［3，9］。

1.4 分子生物学诊断

近年来，分子生物学技术快速发展为曼氏裂头蚴病诊断提供了新途径。目前，曼氏裂头蚴cDNA文库已成功构建［10-11］，通过大规模测序筛选和生物信息学分析，从中已挑选具有潜在诊断价值的Sm18、W1和 W2等抗原基因［10-11］；其中，进行Sm18基因已进行克隆表达，已制备出可用于免疫诊断的重组抗原（Sm18），为研制曼氏裂头蚴免疫诊断试剂盒提供良好基础［10］。兰智华［12］用曼氏裂头蚴线粒体细胞色素C氧化酶1（cox1）特异性基因引物作重复PCR扩增，对鉴定裂头蚴虫体感染重要意义。Bennett H M 等［13］在一例脑裂头蚴病诊断中，以cox1基因为标记并进行序列分析，确诊了脑曼氏裂头蚴感染。整体上而言，分子生物学诊断方法目前尚不成熟，其敏感性、特异性和可靠性需要进一步提高或验证，客观上也极大限制了该方法在临床检测中的应用［10-11，13］。

2 蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断技术

2.1 病原学和分子生物学诊断

迄今为止，病原学检查是蛇蛙曼氏裂头蚴病流行病学调查中最常用的方法。据不完全统计，该方法在乌梢蛇（Zoacysdhumnades）、滑鼠蛇（Ptyas mucosus）、灰鼠蛇（Ptyaskorros）和眼镜蛇（Naja najaatra）等23种蛇类和虎纹蛙（Ranarugulosus）、黑斑蛙（Rananigromaculata）、金线蛙（Rana plancyi）和泽陆蛙（Fejervaryamultistriata）等15种蛙类检测中运用［1，14-24］。近些年，PCR技术也迅速应用于蛇蛙曼氏裂头蚴DNA诊断鉴定方面［20-24］。Liu W 等［20］对黑斑蛙裂头蚴cox1基因进行扩增测序分析，系统发育树分析显示，所有黑斑蛙均为曼氏裂头蚴感染。黎建华［21］通过对黑斑蛙裂头蚴线粒体DNApnad5和prrnS基因的多态性分析，发现pnad5和prrnS两段基因可以作为蛙曼氏裂头蚴有效的遗传标记，并为种内遗传多态性研究提供基础。曾利娟等［22］以湖南4个地区黑斑蛙中采集的曼氏裂头蚴作为研究对象，PCR扩增其nad1基因的部分序列（pnad1）并进行序列分析，结果显示曼氏裂头蚴nad1序列为570bp，为曼氏裂头蚴进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。李雯雯等［23］以从草腹链蛇（Amphiesmastolatum）分离到的1株裂头蚴为研究对象，分别利用核糖体小亚基（18SrDNA）、大亚基（28SrDNA）、内转录间隔区（ITS）和cox1对分离的裂头蚴进行分类鉴定，结果显示该虫株为曼氏裂头蚴，并通过分子种系发育关系推断cox1比ITS更适合用于种内遗传多态性研究，ITS则适合做定种的分子标记。吴有陵［24］对王锦蛇（Elaphecarinata）、赤链蛇（Dinodonrufozonatum）和黑眉锦蛇（Elaphetaeniura）分离到裂头蚴为对象，以cox1基因为分类基因，种系发育树分析显示所分离的裂头蚴都是曼氏裂头蚴。

2.2 蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断中存在的问题

目前，蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断主要依靠虫体基本形态学特征来鉴定，分子生物学检测技术也有一定的进展。然而，在蛇蛙曼氏裂头蚴病鉴定方面仍存在一些问题和挑战。

2.2.1 病原学诊断 病原学检查是曼氏裂头蚴病鉴定的金标准［4］，也是蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断中最常用方法。然而，在当今的蛇蛙曼氏裂头蚴病防控工作中，该检查方法存在以下四个方面缺点：①该方法通常依赖蛇蛙整体剖检过程来完成，需要耗费大量的人力物力，且需要专业的现场及技术人员，在大规模流行病学调查中，不易实施。②野生蛇蛙受法律保护，部分蛇蛙为国家或省重点的保护动物，通过处死大量蛇蛙来开展曼氏裂头蚴病的监测工作，有悖于我国野生动物资源保护的工作目的及理念。③我国南方地区存在食用或药用蛇蛙的传统习俗，每年都会消费大量的蛇蛙，通过专业人员的病原学检查来保障和实现蛇蛙的无害化工作是不现实。④病原学鉴定的主要方式是形态学观测，但这些方法也是不严谨的，并不能对虫株进行精确的定种和种内遗传多样性分析［23］，需要血清免疫学和分子生物学等其他技术的综合应用。

2.2.2 免疫学诊断 目前，免疫学诊断在蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断方面并无应用。虽然在人体曼氏裂头蚴病诊断方面，免疫学方法是成熟的检测技术，且应用广泛，但两爬类动物免疫特征与哺乳类有较大差异，如两爬类动物只存在4种免疫球蛋白类型IgM、IgX（对应于哺乳动物IgA）、IgY（被认为是IgG和IgE的进化前体）和IgF［25］，这给完全照搬人体免疫学诊断技术带来了一定挑战和很大不确定性。蛇蛙曼氏裂头蚴病免疫学诊断技术的建立，要克服或解决以下四个方面问题：①蛇蛙曼氏裂头蚴感染后的特异性抗体IgY或IgM抗体水平和动态变化，为ELISA、DIGFA和 Western blot法在蛇蛙曼氏裂头蚴早期感染和诊断方面的应用提供基础；②蛇蛙IgY或IgM提取和纯化技术，为DIGFA法在蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断中的应用提供质控IgY或IgM；③寻找可被裂头蚴感染蛇蛙血清（特异性抗体IgY或IgM）识别的虫体排泄分泌（ES）抗原，为Western blot法在蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断中的应用提供技术支撑；④积累蛇蛙其他常见寄生虫感染的阳性血清，为ELISA法在蛇蛙曼氏裂头蚴诊断上的交叉反应的验证或排除提供实验材料保障。

2.2.3 影像学诊断 影像学诊断技术在珍稀濒危野生蛇蛙检测方面具有一定前景，对珍稀濒危野生蛇蛙资源保护具有重要应用价值。但该诊断方法需要专业仪器设备，耗费较大，且没有两栖及爬行动物专用的仪器设备，人体影像学仪器设备能否直接应用，尚需大量验证和科学研究。

2.2.4 分子生物学诊断 分子生物学技术快速发展为蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断提供了新途径，但目前仍存在一些问题：①曼氏裂头蚴基因组数据库还不够完善，目的基因筛选也很有限，极大限制了可用于免疫诊断的高度特异性重组抗原的制备；②目前已建立的分子生物学检查方法，主要用于曼氏裂头蚴虫株的定种和种内遗传多样性分析，多从专业科研角度出发来进行探讨和研究，不利于大规模基层推广和应用；③PCR是分子生物学诊断核心技术，其操作复杂，对设备、技术人员及实验条件要求高，单个成本费用也高，如不能基于该技术推出商品化试剂盒，将是该方法推广应用的瓶颈因素。

3 展望

我国南方地区食用或药用蛇、蛙的传统历史悠久［14-16］，要在短期内改变民众传统的消费习俗是困难的和不现实的，因此我国曼氏裂头蚴病防控工作任重而道远。展望未来，为促进我国蛇蛙养殖的产业化、规模化和无害化发展，保障人类公共卫生安全，需要重点开展4个方面工作：①建立蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断的林业行业标准。野生动物疫病监测防控是林业行政主管部门的法定职责，广东省已将蛇蛙曼氏裂头蚴病列入《广东省需要重点监测的野生动物疫病名录》。未来要争取尽快立项和制订“蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断”林业行业标准，为蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断标准化和规范化提供技术支撑；②加大从业人员蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断技术培训。我国野生动物疫病监测防控工作尚处于起步阶段，有关管理人员、业务骨干和养殖人员对蛇蛙曼氏裂头蚴病诊断检测技能薄弱，难以保障和实现我国蛇蛙养殖产业健康发展和食品安全工作，因此，相关从业人员的技能培训工作对从食物源头防控曼氏裂头蚴病具有重要意义；③开发和上市蛇蛙专用曼氏裂头蚴病诊断试剂盒。试剂盒具有简洁、经济、快速和准确等优点，开发和上市蛇蛙专用曼氏裂头蚴病诊断试剂盒，有利于曼氏裂头蚴病诊断技术大规模推广和应用；④重点筛选高度特异性的曼氏裂头蚴目的基因。在成功筛选高度特异性的曼氏裂头蚴目的基因基础上，制备高度特异性重组蛋白，进而开发蛇蛙专用的曼氏裂头蚴病生物工程疫苗或诊断试剂，对曼氏裂头蚴病的源头防控也具有重要意义。

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