新孢子虫与宿主关系研究进展

郭衍冰，曹利利＊，姚新华，苑淑贤，程荣华，王英贺

（1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春130062；2.吉林农业大学，吉林长春130118）

犬新孢子虫（Neosporacaninum）简称新孢子虫，是一种顶复门胞内寄生虫，属孢子虫纲，真球虫目，肉孢子虫科，新孢子虫属。传播途径有水平传播和垂直传播，其中以在牛、羊、鼠、猫等动物中的垂直传播为新孢子虫的主要传播方式［1］。该寄生原虫主要有3个传染性生长阶段，分别是包囊、卵囊和速殖子，其宿主可分为中间宿主和终末宿主，其中牛、羊、猪、马、兔、鹿等可作为中间宿主［2］，郊狼、狐狸等可作为终末宿主［3］，而犬既是中间宿主，又是终末宿主。由此可知，犬新孢子虫病能够在多种动物及种群间相互传播，使感染孕畜流产、死胎，或对新生胎儿的神经系统及运动造成影响［4］，且以其流行范围广的特点给世界各国养殖业，尤其是奶牛业带来巨大经济损失。

据报道，有部分国家采用疫苗防控犬新孢子虫病，效果并不十分理想［5］。可以说，时至今日，世界范围内针对预防和治疗该寄生虫病尚无特效药物［6］。随着我国养殖业的不断发展和寄生虫学研究的不断深入，越来越多的人们关注犬新孢子虫与其宿主间关系的研究，力争探索并创造出更有效诊断及防控该寄生虫病的方法和药物。因此，本文从以下几个方面对两者间关系进行阐述。

1 犬新孢子虫侵入相关抗原

1.1 表面抗原

犬新孢子虫侵入至宿主细胞的过程十分复杂，而在这一过程中虫体的表面抗原发挥着介导入侵及黏附宿主细胞的重要作用。现已研究发现的表面蛋白主要有表面抗原（surface antigen，SAG）及相关表面抗原相关序列（surface antigen-related sequences，SRS）基因家族，因在诊断抗原及免疫抗原过程中，表面蛋白因其表现出的双重价值而备受关注。

1.1.1 SAG1（Nc-p36） SAG1作为介导虫体入侵及黏附宿主细胞的重要表面蛋白，该蛋白分子质量为36ku，含有疏水性氨基端和羧基端，仅产生于速殖子阶段，是区分弓形虫与新孢子虫的主要诊断抗原。2011年张守发等［7］将重组质粒pVAX-SAG1转染至BHK-21细胞上进行表达并免疫Balb／c小鼠，结果显示，能够提高其体液及细胞免疫水平，说明SAG1是免疫组化反应检测感染宿主组织中速殖子的的重要诊断依据［8］。

1.1.2 SRS2（Nc-p43） SRS2作为介导虫体入侵至宿主细胞的重要跨膜蛋白，该蛋白分子质量为43 ku，含有疏水性羧基端和带有信号肽的氨基端，均能产生于速殖子和缓殖子阶段。Nishikawa Y等［9］将带有NcSRS2的重组苗注射Balb／c小鼠，结果使其产生保护性免疫力，说明SRS2可作为诊断研究及疫苗研制的免疫原。据报道，SRS基因家族与弓形虫相似，而SRS2能够有助于人们区别弓形虫进行犬新孢子虫诊断，但目前对于SRS系列基因不甚了解，有待深入研究［10］。

1.2 致密颗粒抗原

致密颗粒常以几个至几十个的数量分布于虫体细胞，当虫体全部进入宿主细胞时，这种分泌细胞器在容纳虫体空泡（PV）的形成初期开始分泌致密颗粒蛋白，因而人们认为致密颗粒蛋白在PV形成过程中发挥了一定的作用，但其分泌途径有待进一步研究。目前，人们对犬新孢子虫致密颗粒抗原（dense granule antigen，GRA）的了解并不十分透彻，据了解已筛选出5种蛋白，分别是NcGRA1、NcGRA2、NcGRA6、NcDG1 和 NTPase［11］。Vonlaufen N等［12］在空泡（PV）的囊壁中发现 NcGRA1、NcGRA2、NcDG1。已知NcGRA2能够在速殖子阶段大量表达，Ellis J T 等［13］研究发现，以 NcGRA2所构建的疫苗具有降低感染率的效果，亦可说明致密颗粒蛋白具有一定修饰空泡（PV）的作用。Nc-DG1表达于速殖子阶段，Liu Z K 等［14］研究发现，宿主染重发病后，始终可在空泡（PV）膜中发现Nc-DG1的存在，表明NcDG1在PV的形成及其膜的修饰过程中具有一定作用。据以往研究表明，NcGRA6与NcDG1可用于预防及诊断新孢子虫病，且与弓形虫无交叉免疫原性。新孢子虫与弓形虫两者NTPase的酶活力相似，氨基酸序列几乎一致且具有交叉免疫原性。

1.3 微线体蛋白抗原

微线体作为新孢子虫的一种分泌型细胞器能够产生的近20种蛋白，而其分泌的微线蛋白抗原（micronemal protein antigen，MIC）在虫体黏附宿主细胞及运动过程中发挥着一定的介导作用。NcMIC2是顶复门寄生虫易位相关蛋白（translocon-associated protein，TRAP）家族中的一员，包含了一个带有整合蛋白（I）的氨基端，一个数量可变的血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）样重复序列，一个跨膜结构域及一个延伸至细胞质中的羧基端，而TSP样重复序列常用于判定该微线蛋白的同源性，据了解，新孢子虫MIC2与弓形虫MIC2同源性达61%。NcMIC3含有4个连续的表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样结构，分子质量为38ku，是一种分泌于速殖子及缓殖子阶段的微线蛋白，功能与NcMIC2类似，都参与了新孢子虫入侵及黏附宿主细胞的过程［15］。

1.4 棒状体蛋白抗原

致密颗粒、微线体和棒状体是犬新孢子虫重要的3种分泌型细胞器。依据虫体速殖子时期中棒状体其致密度高的构造，可通过光学显微镜将其与弓形虫相区别，而目前人们对棒状体所分泌的棒状体蛋白抗原（rhoptry protein antigen，ROP）家族蛋白的了解尚不十分清楚［16］。

2 宿主免疫应答

据以往研究表明，感染后的宿主针对犬新孢子虫的不同生长阶段产生不同的免疫应答，表现为某一阶段的免疫应答主要起到保护宿主的作用，即Th1型免疫应答，而某一阶段主要保护新孢子虫，即Th2型免疫应答。Nazir M M 等［17］研究表明，感染新孢子虫后的宿主能够产生一定的免疫保护力，引起宿主的细胞及体液免疫反应，但两者相较而言以细胞免疫应答为主。

2.1 Th1型免疫反应

Th1型免疫反应能够使机体CD4＋T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ及TNF-α等，促进IgG2a和IgG2b等抗体生成以抑制犬新孢子虫在宿主细胞中的繁殖，同时激活具有杀伤效果的氧自由基、一氧化氮（NO）及其代谢产物等，并且抑制IgG1、IgM和IgE的生成。但值得注意的是，在帮助宿主抗虫体感染的同时，一些Th1型细胞因子还会损坏宿主相关组织。

据了解，IL-2细胞因子能够破坏胎盘滋养层细胞，进而影响母体对胎儿的继续培养。IL-12的不断分泌能够维持Th1型免疫反应的继续进行，而IFN-γ不仅具有激活巨噬及其他单核细胞以促发炎症反应的功效，还可介导IL-12及IgG2的产生，在抗虫体感染初期发挥着重要作用。分泌的TNF-α能够活化某些细胞毒性因子，可导致机体组织损伤。一氧化氮（NO）是一种能活化巨噬细胞的细胞毒效应分子，在发挥抗虫体感染及繁殖作用的同时，通过抑制线粒体呼吸酶和DNA合成酶等酶活性，能够使宿主细胞凋亡。

2.2 Th2型免疫反应

Th2型免疫反应能够使机体CD4＋T淋巴细胞分泌细胞因子IL-4、IL-5及IL-10等，虽然减弱了宿主对犬新孢子虫的抵抗，但对妊娠过程胎盘等组织发育起到了营养和保护作用，而这一时期的新孢子虫更倾向于进行垂直传播［18］。研究表明，IL-4细胞因子水平的高低直接影响着虫体在宿主中的垂直传播情况，同时其水平的提高有助于促进B细胞分泌IgG1抗体［19］。 据报道，IL-10 与 IFN-γ呈负相关［20］，当宿主处于怀孕期时，其细胞因子IL-10水平会有所提升，因其具有抑制IFN-γ生成的作用，可使机体减弱自身的抗虫能力，降低对母体怀孕的影响。

3 虫体侵入宿主细胞的机制

犬新孢子虫依据其不同发育阶段可分为速殖子、胞囊和卵囊等形态，而侵入宿主细胞这一复杂过程是由速殖子阶段的新孢子虫完成，该机制主要以黏附及侵入两个阶段组成，简单来说，在宿主细胞内的速殖子就是循环进行黏附、侵入、繁殖以及释放的一个过程：①黏附。速殖子接触宿主细胞后将信号传导至虫体前端并再次定位，同时诱导微线体分泌能够与宿主细胞膜上相应受体结合的蛋白，以构成可移动的连接区域。②侵入。在棒状体蛋白的修饰及虫体自身的滑动作用下，连接区域的宿主细胞膜开始不断内陷，使虫体自前端起逐渐移进宿主细胞内，直至全部侵入且后端连接区域的细胞膜融合，最终在宿主细胞核附近形成了容纳虫体的空泡（PV）。③繁殖。致密颗粒所分泌的蛋白对空泡进行修饰，以使空泡不被宿主胞内溶酶体裂解或酸化，以此隔离宿主内吞噬系统，有利于新孢子虫进行二分裂繁殖，存在于空泡（PV）中的速殖子繁殖十分迅速，约48h～72h则可繁殖5代～6代。④释放。在信号系统作用下，宿主细胞发生裂解，将胞内的速殖子释放出去，被释放的新孢子虫速殖子则可对宿主细胞发起新一轮的侵入。

4 妊娠期间宿主与虫体间关系

新孢子虫四季均可感染发病，但以夏季为高发季节，以垂直传播为主要传播途径的新孢子虫能够引起怀孕母畜寄生虫血症，且被感染母体无年龄差异，可使胎儿发生母源感染或持续性的内源感染。母体妊娠的整个阶段中，随着妊娠时期的不断发展，母体会在Th1型与Th2型免疫应答间自然的变化，从而使宿主与虫体间的关系发生动态改变。

妊娠初期，母体感染新孢子虫后会产生较强的炎症应答，如产生IL-12或IFN-γ等利于Th1型免疫反应的因子，这些因子能够一定程度上阻止虫体的侵入与繁殖，同时对胎盘等组织的发育造成损伤，因而这种炎症反应在大多产下死胎的母体中普遍存在［21］。而以往试验结果表明，怀孕初期感染低剂量新孢子虫，初乳前血清检测未发现阳性，但在其死后的脑与脊髓中却能检测到该寄生虫特异性DNA。妊娠中期，是被感母体流产的高发时期，许多调查研究表明，由新孢子虫病引起的流产都发生于母体妊娠的4月～6月，为了有效抵抗新孢子虫，细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ等的分泌，增强了Th1型免疫反应效果，导致胎儿或死于母体子宫内，或被母体吸收成木乃伊胎，可以说细胞因子在母体妊娠期间是把双刃剑，在抵抗新孢子虫感染的同时，亦可损伤胎儿。据了解，怀孕母体会不断合成孕酮，抑制NO的产生和NK细胞活性，同时促进Th2型细胞分化，Innes E A等 研究结果表明，新孢子虫更易在怀孕母体细胞内繁殖且进行垂直传播。妊娠后期，IL-4及IL-5水平的不断提高，Th2型免疫反应会增强对宿主胎儿的保护及营养作用。随着母体妊娠期的不断发展，胎儿自身的免疫系统也不断发育，这有助于胎儿更好的抵抗新孢子虫的感染［23］。总之，维持Th1与Th2的动态变化对妊娠期间宿主与新孢子虫间关系至关重要［24］，虫体对宿主母体感染的程度与受感染时间、母源保护性以及胎儿自身免疫活性息息相关。

5 结语

犬新孢子虫作为危害性大、涉及范围广的寄生虫病已引起广泛关注，各国专家对该病进行了多方面研究并获得较大进展［25］，而犬新孢子虫与宿主间关系极为复杂，且存在许多研究难题尚待解决，如对虫体侵入宿主细胞相关蛋白及其机制的掌握较少，对宿主产生保护性免疫应答机制的探索深度不够，虫体致病及遗传变异等相关研究也有待深入等，而现有研究尚驻足于探索发现虫体侵入和毒力蛋白及其功能的初步验证上，这也阻碍了人们对有效防控该寄生虫病药物的研制与开发，目前虽尚未研究出针对预防犬新孢子虫的有效疫苗及治疗药剂，但随着研究的不断深入，相信未来在众多科研人员的共同努力下，定能攻克这一影响养殖业发展的难题。

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