鸭源新城疫病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及抗原性检测

王安平， 朱善元， 王永娟， 吴 双， 左伟勇， 洪伟鸣

(江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300)

新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科副粘病毒亚科禽腮腺炎病毒属的成员，能导致禽类严重的呼吸系统和神经系统疾病，主要特征是呼吸困难、高热、下痢、神经机能紊乱以及黏膜和浆膜出血。以前认为新城疫病毒不会引起水禽致病，自从1997年，王永坤等［1］报道了从病鹅体内分离到了NDV强毒株，从而打破NDV对水禽不致病之说。近年来，鸭、鹅等水禽感染NDV并发病的病例越来越多，也越来越严重，给中国水禽养殖业带来了很大的损失［2-4］。

新城疫病毒是单股负链，不分节段的RNA病毒，基因组编码6种结构蛋白质，分别为核衣壳蛋白质(NP)、磷酸化蛋白质(P)、膜蛋白质(M)、融合蛋白质(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白质(HN)和大分子蛋白质(L)［5-6］。NP蛋白质是NDV核衣壳的主要蛋白质成分，其 N端结合RNA，高度保守，C端含有磷酸化位点和抗原决定簇位点。本研究利用 Bac-to-Bac杆状病毒系统，构建含鸭新城疫病毒NP基因的重组杆状病毒，并在昆虫细胞中表达重组NP蛋白质，为鸭新城疫病毒病的基础研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株和载体

鸭源新城疫病毒、鸭新城疫阳性血清由福建省农业科学院惠赠;Sf9细胞、大肠杆菌DH5α感受态细胞由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存;杆状病毒Bac-to-Bac表达系统(包括转座质粒pFastBac1、E.coli DH10Bac受体菌)购自Invitrogen公司。

1.2 工具酶和试剂

pfu DNA Polymerase、限制性内切酶EcoRⅠ、PstⅠ及T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，Wizard DNA Clean-up System购自美国Promega公司，昆虫细胞培养基Sf-900ⅡSFM(Serum free medium)购自GBICO公司，转染试剂CellfectinⅡReagent购自Invitrogen公司，HRP标记的羊抗鸭IgG、荧光素标记的羊抗鸭IgG均购自美国KPL公司，其他试剂均为国产分析纯级。

1.3 引物的设计与合成

参考GenBank中登录的鸭新城疫病毒NP基因序列设计1对引物，为了便于基因的克隆及表达载体构建等后继工作，在NP基因引物的上、下游5′端分别添加了EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点。通用引物M13F/ M13R参照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统设计，引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。NP基因引物序列为:P1:5′-GCG GAATTCACCATGTCGTCTGTTTTCGACGA-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)，P2: 5′-TAA CTCGAGTCAGTACCCCCAGTCAGTGTC-3′(下划线为PstⅠ酶切位点)。通用引物序列为:P1:5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，P2:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。

1.4 病毒的扩增与总RNA的提取

取10倍稀释的原代病毒0.2 ml接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，于37℃孵化箱孵化。选择24～72 h内死亡的鸡胚，置于4℃过夜，收集尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液总RNA，操作参照说明书。

1.5 NP基因的扩增

根据Invitrogen公司的RT-PCR试剂盒操作说明进行操作，反应程序设定为:25℃10 min，42℃90 min，70℃10 min。PCR反应条件为:95℃预变性3 min;95℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，30个循环;72℃10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 重组转座载体pFastBac-NP的构建

回收的NP基因经EcoRⅠ、PstⅠ酶切后，与经同样酶切的pFastBac1连接，在含100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃培养过夜后，挑取单菌落，提取质粒电泳筛选，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确后送由上海英潍捷基生物技术有限公司测序，鉴定正确的克隆命名为pFastBac-NP。

1.7 重组杆状病毒穿梭载体的构建

参考 Invitrogen公司的 Bac-to-Bac Baculovirus Expression System使用说明，将阳性重组质粒pFast-Bac-NP转化DH10Bac感受态细胞，用含四环素(10 μg/ml)、卡那霉素(50 μg/ml)、庆大霉素(7 μg/ml)、IPTG(40 μg/ml)、X-gal(100 μg/ml)的LB琼脂平板筛选阳性菌落，挑取白色菌落，提取质粒，用通用引物M13F/M13R进行PCR鉴定，扩增条件如下:95℃预变性3 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环;72℃延伸10 min。产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，获得的阳性重组转座子命名为rBacmid-NP。

1.8 重组杆状病毒rBac-NP的制备

将rBacmid-NP参照CellfectinⅡ Reagent转染试剂说明书转染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞。转染后每12 h观察细胞生长状态，直至细胞出现明显的病变，72 h后收集培养基上清液，500 g离心5 min，将上清液转移至新的无菌管中，此即为P1代重组杆状病毒rBac-NP，4℃保存备用。

1.9 Western blot分析

将P1代rBac-NP按感染复数(MOI)为0.1感染对数生长期Sf9细胞，直至细胞出现明显病变(感染后约48～72 h)，收集上清液即为P2代重组病毒，按此方法将病毒传至P3代。将P3代rBac-NP分别按MOI为1、5、10接种24孔板中Sf9细胞，分别在感染后24 h、48 h、72 h收集细胞沉淀，PBS洗涤1次后，于沉淀中加入100 μl 1×Loading buffer煮沸3 min后，取15 μl进行SDS-PAGE分析，以未接种病毒的细胞沉淀作为阴性对照。样品电泳结束后转印PVDF膜，以全病毒鸭抗血清作为一抗，以HRP标记的羊抗鸭IgG作为二抗，按常规方法进行Western blot。

1.10 间接免疫荧光试验

将P3代rBac-NP分别按MOI为1、5、10接种24孔板中Sf9细胞，在感染后48 h弃去上清液，PBS洗涤2次后，常规程序进行细胞免疫荧光，以全病毒鸭抗血清为一抗，以荧光素标记的羊抗鸭IgG为二抗。同时以未接种病毒的细胞作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 NP基因的扩增

NP基因PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可见大约1 500 bp的条带(图1)，与预期结果相符。

图1 目的基因的PCR扩增结果Fig.1 Amplification of target genes by PCR

2.2 重组转座载体pFastBac-NP的构建与鉴定

疑似重组质粒经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后出现约1 600 bp和4 800 bp两条带(图2)，与预期相符，且DNA测序证明NP基因克隆正确且无突变。

2.3 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定

以提取的疑似含有NP基因的重组杆粒DNA为模板，分别以NPP1/NPP2、M13P1/M13P2为引物进行PCR鉴定，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后分别在约1 600 bp和4 800 bp处可见特异性条带，与预期片段大小相符(图3)，而空载体对照组未出现特异条带，表明NP基因转座成功，获得的重组杆粒正确。

图2 重组质粒pFastBac-NP的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction endonucleases digestion

图3 重组转座子的PCR鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4 重组杆状病毒的收获及感染细胞的病变

rBacmid-NP转染对数生长期昆虫细胞 Sf9， 5 d后可见细胞变大，细胞生长停止，细胞内出现颗粒，有些细胞肿大而破碎等明显的细胞病变现象，而未转染组的细胞未出现此现象。

2.5 F基因在昆虫细胞中的表达

2.5.1 Western blot鉴定 P3代 rBac-NP感染24孔板中对数生长期的 Sf9细胞，细胞沉淀经SDS-PAGE电泳后，采用鸭抗全病毒血清为一抗进行Western blot检测，结果在约53 000处出现特异条带(图4)，分子量与目的蛋白质相同，而正常Sf9细胞未出现相应条带，说明重组蛋白质在昆虫细胞中获得了成功表达，且具备良好的反应原性。

图4 重组蛋白质的Western blot鉴定Fig.4 Western blot identification of recombinant protein

2.5.2 间接免疫荧光试验 P3代rBac-NP感染24孔板中对数生长期的Sf9细胞，以鸭抗全病毒血清为一抗进行间接免疫荧光分析，结果显示在感染rBac-NP的Sf9细胞中观察到了特异性荧光，而在对照孔细胞中未出现荧光(图5)。

3 讨论

自1997年以来在江苏、山东等地相继报道了鹅副粘病毒病以后，鸭源NDV也相继从发病鸭群中分离到，近些年鸭、鹅等水禽感染NDV并发病的病例越来越多，给中国的水禽养殖业带来了较大的损失。目前，疫苗接种仍然是预防和控制该病的主要手段和方法。NP蛋白质是NDV的核衣壳蛋白质，与病毒基因组RNA结合形成螺旋堆成的卷曲状结构［7］。不同毒株间NP基因的保守性很高，NP蛋白质在病毒粒子中是最丰富的蛋白质，具有天然的免疫原性，但不具有免疫保护作用，常用于监测疫苗接种程序和新城疫诊断中［8］。本试验利用鸭源新城疫病毒福建强毒株为研究对象，利用分子克隆技术克隆出NP基因片段，将其克隆入Bac-to-Bac杆状病毒载体中并且获得了成功表达。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种比较成熟的真核表达系统，具有阳性重组率高、操作简便、成本低等优点，尤其是该系统可以获得大量的、免疫原性较好的、与天然蛋白质功能相似的可溶性重组蛋白质，因此被广泛应用于药物开发、重要药用蛋白质及疫苗研究等多个领域［9-11］。

本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒NP基因。首先将NP基因克隆入杆状病毒转移载体pFastBac1中，转化感受态细胞DH10Bac，经抗性基因和蓝白斑筛选随机挑取白色菌落，分别以NP基因上、下游引物和M13上、下游引物进行PCR鉴定，以蓝色菌落为阴性对照，结果证实白色菌落为重组成功的阳性转座子。提取其DNA，脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞，72 h后细胞出现典型病变。Westertn blot分析重组蛋白质表达产物，有一条约53 000的特异性条带，与理论值相符，且重组蛋白质与鸭抗全病毒血清也呈现了良好的反应原性，说明本系统表达的重组NP蛋白质可用于鸭源新城疫病毒的诊断和检测。

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