比色生物传感器检测Cd2+*

张婷婷，张瑞英，陈 镇，罗义庭，熊兴良

(重庆医科大学 生物医学工程研究室，重庆400016)

0 引 言

镉离子(Cd2+)是一种广泛存在于空气、水和食物中的对人体健康危害极大的重金属污染物。Cd 中毒能导致肾功能衰退、生殖障碍、Itai－Itai 病、骨质疏松、呼吸系统疾病等。长期、低剂量Cd2+暴露能显著增加患癌的危险［1］，因此，国际抗癌联盟(IARC)将其确定为Ⅰ类致癌物。传统的重金属检测方法主要有原子吸收法(AAS)、阳极溶出伏安法(ASV)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP－AES)等［2］。这些方法灵敏度高、特异性强，但存在样品前处理复杂、操作耗时、仪器昂贵、需要专业人员操作等缺陷，难以满足快速、实时的检测［3］。美国环境保护署(EPA)规定饮用水中Cd2+含量不超过10×10－9，但基于应急检测的某些特殊水质标准(如军队战时饮用水卫生标准)将上述Cd 含量的限值放宽10 倍甚至100 倍以上［4］。因此，开发一种快速、简便、高灵敏和高选择性的Cd2+检测技术具有重要的意义。

纳米金(AuNPs)是尺寸在1～100 nm 的金颗粒，具有局部表面等离子共振性质，颗粒聚集能使溶液的颜色发生裸眼可视的变化［5］。Wang A J 等人［6］、Xue Y 等人［7］、Zhang M 等人［8］分别利用小分子、缩氨酸功能化制备AuNPs 探针检测Cd2+，选择性不好。有报道利用DNA 修饰的AuNPs比色检测Hg2+［9，10］，Pb2+［11，12］等重金属离子，此方法选择性和灵敏度更好，但对Cd2+的检测尚未见报道。本文提出了一种新型的基于AuNPs 的比色传感器检测Cd2+。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

AuNPs 选 购 自 Sigma－Aldrich 公 司;Cd(NO3)2，Pb(NO3)2，Cu(NO3)2及其它金属离子的固体样品购自上海强顺化学试剂有限公司;ssDNA(DNA1:5’－GGGGCAGTGC－CTCACAACCT－3’DNA2 :5’－GAAAAGTTTTGCTAACTACGA－3’DNA3:5’－TTTTTTTTTTAAAAACCCCC－3’)购自宝生物工程(大连)有限公司;其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水，电阻大于或等于18.3 MΩ·cm。

UV－2550 UV－Vis 紫外—可见分光光度计(日本岛津公司);HT7700 型透射电子显微镜(日本日立公司);水浴锅(上海普渡生化科技有限公司);佳能A640 数码相机;优普超纯水制造系统(西安优普仪器设备有限公司)。

1.2 检测方法

实验选用的DNA1 能与Cd2+发生特异性结合［13］。参照Li D 等人［14］提出的检测Hg2+的方法进行改进，将2.1 μmol/L DNA 与0.5 μmol/L Cd(NO3)2混合，85 ℃水浴加热5 min 以防止DNA 形成双链并加速DNA 与Cd2+的反应，冷却至室温后加入6 nmol/L AuNPs，5 min 后再加入0.2 mol/L NaCl，20 min 后观察溶液的颜色变化，实验溶剂为pH=7.4 的Tris－HCl。有Cd2+存在时，DNA1 与Cd2+特异性结合，AuNPs 暴露在盐溶液中发生聚集;没有Cd2+存在时，DNA 通过Au－N 键与AuNPs 发生非共价键吸附［15］，阻止AuNPs 的聚集(图1)。

图1 Cd2+-ssDNA 复合物介导AuNPs 聚集Fig 1 Cd2+-ssDNA compound mediated AuNPs gathered

2 结果与讨论

2.1 NaCl 浓度的影响

比色检测法的灵敏度与AuNPs 抗聚集能力有关，在高离子强度下，AuNPs 之间的静电排斥较弱，金属离子更容易介导AuNPs 聚集［16］。NaCl 浓度是使AuNPs 不稳定的显著因素，使其浓度最优化，能得到更低的检测限。图2 插图显示了在DNA 与AuNPs 的混合溶液中加入不同浓度的NaCl(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mol/L)80 min 后的颜色变化，明显看出0.4 mol/L 及以上浓度的NaCl 使AuNPs 聚集，溶液变紫。为使未添加Cd2+时溶液颜色稳定，本文研究NaCl 浓度为0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L时，DNA－AuNPs 溶液对1 μmol/L Cd2+的反应，记录紫外—可见吸收光谱如图2(a)所示，波峰随着NaCl 浓度的升高而右移，在620 nm 左右出现新的吸收峰。利用A620/A520的比值来表示AuNPs 的聚集程度，相同浓度Cd2+条件下，A620/A520与NaCl 浓度的关系如图2(b)所示，随着NaCl 浓度升高，AuNPs 的聚集程度增加，直到0.2 mol/L 之后趋于稳定，考虑到NaCl 浓度过高会影响溶液的背景颜色，本实验选择0.2 mol/L 为NaCl 的最佳浓度。

图2 NaCl 浓度的影响Fig 2 Influence of different concentrations of NaCl

2.2 灵敏度

在最佳实验条件下(2.1 μmol/L DNA1，0.2 mol/L NaCl，pH=7.4 Tris－HCl)添加0～40 μmol/L 的Cd2+，分别培养20 min 后的紫外—可见吸收光谱记录如图3，随着Cd2+浓度的升高，520 nm 左右的吸收峰逐渐减小，在640 nm 左右出现了新的吸收峰，且明显的红移。溶液的颜色由红变蓝紫，如图3 插图所示，Cd2+浓度为0.5 μmol/L 时开始观察到肉眼可见的由红到紫的颜色变化，证明了AuNPs 在Cd2+－DNA 复合物的介导下发生了聚集。

图3 添加不同浓度Cd2+(0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2 μmol/L)的DNA-AuNPs 溶液紫外—可见吸收光谱和照片Fig 3 UV-vis spectra and photograph of DNA-AuNPs in the presence of different of Cd2+(0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75，2 μmol/L)

2.3 选择性

用相同浓度的其它离子(K+，Ca2+，Co2+，Al3+，Zn2+，Cr3+，Mn2+，Cu2+，Pb2+)代替2 μmol/L Cd2+在最佳条件下实验，颜色变化如图4 插图，Cd2+溶液颜色完全变紫，Cu2+，Pb2+有轻微颜色干扰，吸光度比A640/A520看出只有添加Cd2+的溶液中AuNPs 发生聚集，Cu2+，Pb2+干扰轻微。

图4 1 μmol/L Cd2+以及其它金属分别得到AuNPs 的吸光度比A640/A520(培养时间20 min)Fig 4 The ratio of A640/A520 of AuNPs in the presence of 1 μmol/L Cd2+or other metal ions(incubation time is 20 min)

3 结 论

本文建立了一种新的基于Cd2+－DNA 复合物介导AuNPs 聚集检测Cd2+的比色生物传感器。该传感器利用AuNPs 局部表面等离子共振性质将化学能转换为裸眼可见的光信号，并放大，最佳实验条件下检测限可低至0.5 μmol/L，且对与Cd2+性质极其相似的Zn2+不响应，Cu2+，Pb2+有轻微干扰。该传感器操作简单、成本低，且十分新颖，实际应用潜力巨大。

［1］ Sinicropi M S，Amantea D，Caruso A，et al.Chemical and biological properties of toxic metals and use of chelating agents for the pharmacological treatment of metal poisoning［J］.Arch Toxicol，2010，84(7):501－520.

［2］ 江天久，牛 涛.重金属污染物的免疫学检测技术研究进展［J］.生态环境，2005，14(4):590－595.

［3］ 寇冬梅，张进忠，杨 兵，等.检测重金属离子的酶膜生物传感器的构建［J］.环境科学与技术，2008，31(9):24－28.

［4］ 戚红卷，陈雯雯，岳丽君，等.纳米金比色法快速检测水中重金属的研究进展［J］.环境化学，2013，32(1):21－28.

［5］ Saha K，Agasti S S，Kim C，et al.Gold nanoparticles in chemical and biological sensing［J］.Chem Rev，2012，112(5):2739－2779.

［6］ Wang A J，Guo H，Zhang M，et al.Sensitive and selective colorimetric detection of cadmium(II)using gold nanoparticles modified with 4－amino－3－hydrazino－5－mercapto－1，2，4－triazole［J］.Microchimica Acta，2013，180(11/12):1051－1057.

［7］ Xue Y，Zhao H，Wu Z，et al.Colorimetric detection of Cd2+using gold nanoparticles cofunctionalized with 6－mercaptonicotinic acid and L－Cysteine［J］.Analyst，2011，136(18):3725－3730.

［8］ Zhang M，Liu Y Q，Ye B C.Colorimetric assay for parallel detection of Cd2+，Ni2+and Co2+using peptide－modified gold nanoparticles［J］.Analyst，2012，137(3):601－607.

［9］ Liu C W，Hsieh Y T，Huang C C，et al.Detection of mercury(II)based on Hg2+－DNA complexes inducing the aggregation of gold nanoparticles［J］.Chem Commun，2008，21(19):2242－2244.

［10］Fang C，Wang C G，Wang T T，et al.L－cysteine functionalized gold nanoparticles for the colorimetric detection of Hg2+induced by ultraviolet light［J］.Nanotechnology，2010，21(2):1－6.

［11］Liu J，Lu Y.A colorimetric lead biosensor using DNAzyme－directed assembly of gold nanoparticles［J］.J Am Chem Soc，2003，125(22):6642－6643.

［12］Ding N，Cao Q，Zhao H，et al.Colorimetric assay for determination of lead(II)based on its incorporation into gold nanoparticles during their synthesis［J］.Sensor，2010，10(12):11144 －11155.

［13］Wong E L，Chow E，Gooding J J.The electrochemical detection of cadmium using surface－immobilized DNA［J］.Electrochemistry Communications，2007，9(4):845－849.

［14］Li D，Wieckowska A，Willner I.Optical analysis of Hg2+ions by oligonucleotide－gold－nanoparticle hybrids and DNA－based machines［J］.Angew Chem，2008，120(21):3991－3995.

［15］Zhang X，Servos M R，Liu J W.Surface science of DNA adsorption onto citrate－capped gold nanoparticles［J］.Langmuir，2012，28(8):3896－3902.

［16］Lin C Y，Yu C J，Lin Y H，et al.Colorimetric sensing of silver(I)and mercury(II)ions based on an assembly of Tween 20－stabilized gold nanoparticles［J］.Anal Chem，2010，82(16):6830－6837.