多菌种共固定化发酵制备枸杞红枣乳酸饮料

徐 敏，田 辉，杜金城，丁秀云，于上富，霍贵成*

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

枸杞（Lycium chinense）又名“却老子”，含有大量VA、VB1、VB2及铁、钙等多种矿物质元素。红枣又名大枣，含有丰富的维生素C等，被誉为“天然维生素丸”[1]。NEDOVIC V A等[2]通过共固定酵母菌和明串珠菌后，研究其对苹果酒的连续发酵的影响，结果表明，该方法可以较好地改善苹果酒的风味与质量。另外，SCOTT J A等[3]用海绵状材料将酵母菌与风味菌种共固定，然后用于苹果酒饮料的生产，结果表明，应用共固定化技术，酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵两个过程，这两个发酵过程可以在一个反应器中同时进行，大大简化了苹果酒的生产工艺。在国内对细胞共固定化技术的研究始于陈佩华等[4]采用吸附-包埋的方式，将酵母菌、黑曲霉及其产生的糖化酶共同固定在甘蔗渣上，经过增殖培养，直接将淀粉转化为酒精。本研究期望为枸杞红枣乳酸饮料产业提供技术依据，为提高水果产业的附加值提供新的动力支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞和鲜大枣：市售；保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌粉：乳品科学教育部重点实验室。

蛋白胨、牛肉膏：北京奥博星生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：英国OXOID公司；葡萄糖、琼脂、磷酸氢二钾：天津光复科技发展有限公司；硫酸锰、柠檬酸氢二胺、乙酸钠：天津东丽区天大化学仪器厂；Tween-80：天津光复精细化工研究所；以上试剂均为分析纯。

MRS培养基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1.1 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二氨2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水950 mL；固体培养基添加1.6%的琼脂粉，121 ℃高压灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

豆浆机：九阳公司；DU800紫外可见分光光度计：美国BECKMAN公司；GL-21M离心机：上海市离心机械研究所；DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；PL2002电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HVE-50全自动高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；XK96-A快速混匀器：姜堰市新康医疗器械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 枸杞红枣乳酸饮料生产工艺流程

1.3.2 工艺要点

枸杞原汁制备：鲜枸杞清洗后，用豆浆机榨汁后用3层纱布过滤后5 000 r/min离心10 min，得澄清枸杞原汁，4 ℃保存备用。

枣汁的制备：将新鲜的大枣清洗后人工去核，用豆浆机榨汁后纱布过滤，以去除大的枣皮，最后5 000 r/min离心20 min，得澄清枣汁，4 ℃冰箱保存备用。

菌种活化及菌落观察：

（1）菌种的活化

将从-20 ℃冰箱取出的乳酸菌在室温条件下融化，以2%的接种量接种到5 mL的MRS液体培养基中进行活化，37 ℃培养14 h后，用混匀器将培养液充分混匀，用接种环在培养液中轻沾少许液体，在MRS固体培养基上进行三区划线，37 ℃培养。

（2）菌体及菌落形态的观察

菌株在MRS固体培养基上培养24 h后，选取一个较大菌落，挑取其中的1/2菌落，进行革兰氏染色和油镜观察，并照相。

（3）生长曲线的测定

用接种环挑取另外的1/2菌落，接种于MRS液体培养基中，培养约14 h，以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，培养约14 h时，再以2%接种量分别接种于54个盛有MRS液体培养基的试管中，并在54个试管分别标上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h（共18个时间段，每个时间段3个平行），37 ℃恒温培养，从起点开始计时当到达上述时间时，将对应的3支试管取出放入4 ℃冰箱中，待18个时间段全部取出后一起用紫外分光光度计测定pH；采用梯度平板稀释法测定0～30 h内的活菌数，重复3次，作生长曲线。

梯度平板稀释法：无菌操作，将培养好的菌液摇匀，吸取1 mL加入9 mL无菌生理盐水中，制成1∶10的稀释液，再依次进行10倍递减梯度稀释，至适当稀释度，吸取1 mL置于灭菌的培养皿中，倒入约15 mL、50 ℃左右的MRS琼脂培养基，轻轻摇匀。待培养基凝固后，置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h后进行菌落计数，结果以CFU/mL表示。

将混合菌粉接种于MRS液体培养基内，37 ℃培养24 h，传代2～3次后，取将对数期后稳定期初的嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌菌液离心（5 000×g，4 ℃，10 min）收集菌体，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate butter saline，PBS）清洗3次，用无菌PBS重悬菌体，制备细胞悬液，并调整菌浓度为108CFU/mL，于4 ℃储存，备用。

微生物细胞固定化方法：将10 mL（菌数约为108CFU）保加利亚乳杆菌嗜热链球菌细胞悬液，加入一定含量的海藻酸钠溶液（固定化载体溶液），用涡旋振荡器混匀5 min，用一次性注射器取20 mL左右的海藻酸钠溶液，滴进氯化钙溶液（固定化颗粒），进行造粒，4 ℃条件，固定化20 h左右备用。

发酵原液的调配：取适量的枸杞汁，然后用饱和碳酸钠溶液调pH，当pH值约为7.0时，对发酵原液进行巴氏消毒，然后室温条件下冷却20 min，再按一定的比例加入大枣汁，以此，制备发酵原液[5-7]。

1.3.3 测定方法

固定化载体机械强度的测定方法：在固定化载体的正面，用50 g砝码按压，以其能承受的最大压力来表示固定化载体的机械强度；固定化载体的机械强度计算公式[8]：

式中：d为施压前后固定化载体的直径差，mm；50为砝码质量，g；R为施压前固定化载体的半径，mm；r1、r2、r3为施压后固定化载体的半高度，mm；π为圆周率3.14；Pi为固定化载体的机械强度，g/mm2；P为平均固定化载体的机械强度，g/mm2。

还原糖及乳酸测定方法：还原糖的含量测定采用DNS法；乳酸的含量测定采用酸碱滴定法[9]。

感官评价指标：随机选取50名性别不同、年龄各异、语言表达能力强的人员进行感官评价，每组20人均进行评分，排除偏差，试验结果取平均值，然后进行分析，枸杞红枣乳酸饮料的感官评分标准如表1（满分100分）。

表1 枸杞红枣乳酸饮料的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of Lycium chinense and date yoghourt drink

2 结果与分析

2.1 枸杞汁、大枣汁比例对发酵的影响

枸杞汁、大枣汁的比例一定程度上影响着乳酸菌的发酵效果，以枸杞汁与大枣汁体积比1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1的比例[10-12]，接种量为10%的混合菌株，37 ℃发酵26 h进行试验，以感官评价为标准，筛选出两种果汁最佳配比，结果见表2。

表2 发酵原液配比对发酵的影响Table 2 Effect of fermentation broth ratio on fermentation

由表2可知，随着枸杞汁所占比例的增大，组织状态逐渐变差、酸味逐渐变弱；枸杞汁与大枣汁的体积比为1∶2时能达到较好的产酸效果又不会出现严重分层现象；所以选择枸杞汁和大枣汁的比例为1∶2进行后续试验。

2.2 海藻酸钠和氯化钙对固定化颗粒特性的影响

氯化钙和海藻酸钠是影响固定化载体特性的主要因素；故选取氯化钙浓度和海藻酸钠质量分数的不同比例，以机械强度为评价指标进行试验，从而选出适宜的两者比例用于制备红枣枸杞乳酸饮料。参考相关文献[13]，本试验设置了4个氯化钙浓度：0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L和4个海藻酸钠质量分数：4%、5%、6%、7%；试验结果见表3。

表3 海藻酸钠含量和氯化钙浓度对固定化颗粒特性的影响Table 3 Effect of calcium chloride and sodium alginate concentration on immobilized yeast characteristics

由表3可知，随着氯化钙含量的减小，固定化颗粒的机械强度呈现增大的趋势；而同时，随着海藻酸钠含量的减小，整体上，固定化颗粒的机械强度的趋势为减小趋势；氯化钙浓度与机械强度呈负相关，而海藻酸钠含量与机械强度之间呈正相关。当氯化钙浓度为0.05 mol/L，海藻酸钠含量为7%时，固定化颗粒的机械强度可达23.11 g/mm2；因此13号处理为最优组合，即氯化钙浓度为0.05 mol/L，海藻酸钠含量为7%，选择此组合进行后续试验。

2.3 接种量对产品品质的影响

在上述最优条件获得的基础上，参考相关文献[14-15]，关于乳酸菌的接种量，分别选取2%、6%、10%、14%、18%五个梯度，37 ℃发酵26 h；以乳酸饮料组织状态、口感为指标，筛选出混合菌株最佳接种量，结果见表4。

表4 混合菌株接种量对产品组织状态的影响Table 4 Effect of mixed strains inoculum on organization status of product

由表4可知，随着接种量的增加，组织状态越差，容易分层，而酸味随着接种量的增加而增加；综合考虑，选取混合菌株的接种量为10%。

2.4 发酵时间对产品品质的影响

在上述最优条件的基础上，参考相关文献[16]，在接种量为10%，37 ℃条件下分别发酵15 h、25 h、35 h、45 h，以乳酸饮料色泽、口感为评价指标，筛选出混合菌株最佳发酵时间，结果见表5。

表5 发酵时间对产品品质的影响Table5 Effect of fermentation time on product quality

从表5可以看出，随着发酵时间的延长，乳酸饮料的颜色越深；然而，随着发酵时间的延长，乳酸饮料的酸味越重；当浸提时间为35 h时，饮料的色泽和口感较佳，故选择的发酵时间为35 h。

2.5 蔗糖添加量的确定

参考本研究预试验的结果及相关参考文献，选取蔗糖添加量4%、6%、8%、10%4个添加梯度[17]，按照工艺流程图与枸杞红枣果汁混合物混合，斡旋振荡器振荡10 min，然后加入嗜热链球菌保加利亚乳杆菌进行发酵，以感官评价得分为评价指标，确定制备枸杞红枣乳酸饮料蔗糖的最佳添加量。

表6 蔗糖添加量对乳酸饮料品质的影响Table 6 Effect of sucrose addition on product quality

由表6看出，随着蔗糖添加量的变大，组织状态越来越有厚重感，而味道越来越甜；当添加量为8%时，产品的组织状态与风味均达到了较好的状态，综合各方面的因素考虑，初定确定蔗糖添加量为8%。

2.6 正交试验

根据上述试验结果，本研究初步认为影响枸杞红枣乳酸饮料品质的主要因素为保加利亚乳杆菌嗜热链球菌混合菌接种量、蔗糖添加量和发酵时间，所以以接种量、蔗糖添加量和发酵时间为3个试验因素，每个因素选取3个水平，进行正交试验，其因素与水平见表7。

表7 枸杞红枣乳酸饮料发酵条件优化正交试验因素与水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization

表8 枸杞红枣乳酸饮料发酵条件优化正交试验结果与分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization

由表8可知，影响品质的重要因素为接种量，其次为蔗糖添加量；从9个处理可以直观的看出，最好的组合是A2B2C3，即接种量为10%，发酵时间为35 h，蔗糖添加量为9%。在此最佳条件下，感官评分为92分。

3 结论

研究结果表明，当枸杞汁、红枣汁的体积比为1∶2，氯化钙物质的量浓度为0.05 mol/L，海藻酸钠质量分数为7%，接种量为10%，发酵时间为35 h，蔗糖添加量为9%，添加适量甜味剂、乳酸钙等辅料时，枸杞红枣乳酸饮料产品品质良好，发酵速度适宜。

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