超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素工艺研究

尹 燕,冯炜弘,杨道兰,汪建旭,张 艳,王永林

(兰州市农业科技研究推广中心,甘肃兰州 730010)

超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素工艺研究

尹 燕,冯炜弘,杨道兰,汪建旭,张 艳,王永林*

(兰州市农业科技研究推广中心,甘肃兰州 730010)

芹菜废弃茎叶中含有丰富的天然叶绿素,充分利用废弃资源,对于部分缓解紧缺的天然叶绿素资源及保护环境具有积极作用。在有机溶剂提取法的基础上采用单因素实验及Box- Behnken中心组合设计对芹菜废弃茎叶叶绿素超声波辅助提取工艺进行了优化。结果表明,用超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素的最佳条件是:液料比20mL/g,提取时间75min,提取温度50℃。此时样品叶绿素溶出量预测值为9.796mg/g,验证值为9.629mg/g。

芹菜废弃茎叶,叶绿素,超声波辅助提取,响应面法

芹菜(Apiumgraveolens)属伞形花科植物,含有类黄酮、叶绿素和膳食纤维等多种生物活性物质[1],是一种低热量、高纤维和高营养价值的食物[2]。近年来,我国芹菜种植面积一直保持在55万hm2左右,高居世界首位。由于人们长期的饮食习惯,芹菜采收后,在鲜销和初加工过程中,可食用部分仅为其肉质直立的叶柄下半部分,而占整个植株生物量30%左右的叶片及其叶柄上半部分往往作为废弃物被扔掉,这些废弃茎叶含水率及有机质含量较高,堆放或填埋会产生大量渗滤液,造成严重的环境污染。

叶绿素是一种安全无毒的天然脂溶性色素,广泛存在于绿色植物中。叶绿素及其衍生物具有抗诱变[3]、抗氧化[4]、预防癌症[5]等功能,在医药、食品和日化工业中用途广泛[6]。目前叶绿素提取方法主要集中在以下几种:丙酮研磨法、有机溶剂浸泡法、超声波辅助提取法、微波辅助提取和超临界流动萃取法。国内外用于产业化提取天然叶绿素的原料主要有蚕沙、菠菜、竹叶等。寻求新的叶绿素提取原料,探索高效节能提取技术,是叶绿素提取、制备领域的发展方向[7]。

超声波技术是利用超声波在溶剂中产生的振动、空化和搅拌作用破坏组织细胞,使细胞内的有效成分迅速溶出[8]。目前超声波技术已用于紫丁香叶[9]、萝卜缨[10]、构树叶[7]等叶绿素的提取,但尚未有芹菜废弃茎叶叶绿素提取的报道。本研究以芹菜废弃茎叶为原料,利用超声波辅助提取,并在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken中心组合设计优化叶绿素的提取工艺,以期为芹菜废弃茎叶叶绿素的提取及产业化开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

芹菜废弃茎叶 2013年9月对兰州市榆中县茂祥蔬菜保鲜库的新鲜、无腐烂芹菜废弃茎叶(品种为加州王)进行采样,50℃左右干燥至恒质量,粉碎后过40目筛,密封、避光保存备用;所用试剂均为分析纯。

101-3AB恒温干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;KQ-250TDE 高频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司(舒美);UV-2450紫外分光光度计 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 叶绿素提取方法筛选 有机溶剂乙醇提取法[11]:称取粉碎40目的芹菜废弃茎叶5g,用25mL的95%乙醇在60℃恒温水浴2h,过滤后,滤渣再用25mL 95%乙醇同温度下提取2h,合并两次滤液,吸取0.1mL提取液至100mL容量瓶中,用丙酮定容,在645nm和663nm下测定叶绿素吸光度,通过公式计算叶绿素溶出量。

超声波辅助提取法[12]:称取粉碎40目的芹菜废弃茎叶5g,用25mL的95%乙醇在室温条件下用超声波处理(功率200W)60min,过滤,吸取0.1mL提取液至100mL容量瓶中,用丙酮定容,在645nm和663nm下测定叶绿素吸光度,通过公式计算叶绿素溶出量。

1.2.2 单因素实验 根据1.2.1所得实验结果,称取粉碎40目的芹菜废弃茎叶5g,采用95%乙醇,在功率200W超声波条件下处理,分别考察液料比(10、15、20、25、30mL/g)、提取时间(20、40、60、80、100min)、提取温度(30、40、50、60、70℃)3个因素对芹菜叶绿素溶出量的影响。

1.2.3 响应面法优化芹菜废弃茎叶叶绿素提取工艺 在单因素实验的基础上,根据Box-Benhnken Design的中心组合实验设计原理,采用软件Design-Expert 8.0.5建立三因素三水平的实验,确定芹菜废弃茎叶叶绿素提取的最佳工艺条件。以叶绿素溶出量(Y)为考察指标,液料比(A)、提取时间(B)及提取温度(C)为自变量,因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken设计因素水平编码表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.4 叶绿素溶出量的测定 将芹菜废弃茎叶叶绿素溶液稀释一定倍数,分别于645nm和663nm波长处测定其吸光度值,根据下面的Arnon修正公式计算叶绿素溶出量[10]。

式中:Y-叶绿素溶出量,mg/g;A645-叶绿素溶液在645nm处测得的吸光度值;A663-叶绿素溶液在663nm处测得的吸光度值;V-溶液体积,mL;W-芹菜废弃茎叶粉末的质量,g。

1.3 数据处理方法

所有实验均重复3次,实验数据的处理采用Design - Expert 8.0.5 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 芹菜废弃茎叶叶绿素提取方法确定

由图1可知,超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素溶出量为乙醇提取的1.99倍。与传统的溶剂萃取法相比,超声波产生强烈的振动、空化作用和搅拌作用,不仅大大缩短了提取时间,而且提高了有效成分的得率,这与王丰俊[7]等的研究结果一致。

图1 不同提取方法对芹菜废弃茎叶叶绿素溶出量的影响Fig.1 Effect of extraction methods on the chlorophyll dissolution of discarded stems and leaves of Apium graveolens

2.2 超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素的单因素实验结果

2.2.1 液料比对芹菜废弃茎叶叶绿素溶出量的影响 由图2可知,随着液料比的增加,叶绿素溶出量逐渐升高,当液料比增加到20mL/g时,叶绿素溶出量达到最大,这可能是因为随着液料比增大,物料和溶剂的接触面积增加,提高了叶绿素的扩散速度,同时液料比增大会降低溶液的黏度,有利于超声波的搅拌作用,使得叶绿素的溶出量增大[13];液料比继续增加时,叶绿素溶出量呈下降趋势,这可能是因为使用的溶剂增多,超声波在较多溶剂的体系中,被溶剂介质吸收而衰减的能量较多,使提取出来的叶绿素量减少[9]。最终确定的最佳液料比为20mL/g。

图2 液料比对叶绿素溶出量的影响Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the chlorophyll dissolution

2.2.2 提取时间对芹菜废弃茎叶叶绿素溶出量的影响 由图3可知,随着提取时间的延长,叶绿素溶出量不断增加,当达到80min时,叶绿素溶出量最高,其原因可能是随着超声波处理时间的延长,超声波空化作用增强,使细胞破碎程度增大,加速了细胞内叶绿素的溶出;再延长超声提取时间,叶绿素溶出量反而降低,这可能是由于超声时间增加,超声热效应变大,使得热敏性物质叶绿素结构遭到破坏,发生了一定的降解[14]。最终确定的最佳提取时间为80min。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

图3 提取时间对叶绿素溶出量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the chlorophyll dissolution

注:* 为5%显著水平,** 为1%显著水平。

2.2.3 提取温度对芹菜废弃茎叶叶绿素溶出量的影响 由图4可知,随着提取温度的增加,叶绿素溶出量呈先上升后下降的趋势。40～50℃时,叶绿素溶出量明显提高,这是由于提高提取温度,分子的扩散速率增加,叶绿素溶出量增大;当温度超过50℃时,叶绿素溶出量反而下降,这可能与其叶绿素本身的热不稳定性有关,在60℃以上叶绿素较易被热分解[7]。最终确定的最佳提取温度为50℃。

图4 提取温度对叶绿素提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the chlorophyll dissolution

2.3 超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素工艺条件的响应面法优化

2.3.1 二次回归模型的建立及显著性检验 在单因素实验的基础上,以液料比、超声波提取时间、提取温度为考察因素,进行三因素三水平中心组合实验,结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Design and result of Box-Behnken

利用Design-Expert 8.0.5软件对所得的实验数据进行多元回归拟合,得到芹菜废弃茎叶叶绿素溶出量(Y)对液料比(X1)、提取时间(X2)和提取温度(X3)的回归模型方程:

Y=9.75+0.19X1-0.18X2+0.067X3+0.013X1X2-0.230X1X3+0.078X2X3-1.32X12-0.54X22-0.67X32

对上述拟合回归方程进行方差分析和显著性检验,结果见表3和表4。

由表3可以得出,模型p值检验表明显著,失拟项的p>0.05,不显著,表明拟合程度明显,模型的预测值接近实际值,进一步说明该方程是显著的,此实验方法可靠。因此,可用该回归模型进行实验结果分析。同时,由于表3中p值小于0.05的对应项为模型影响显著项,因此,本模型中X1、X2、X1X3、X12、X22、X32对结果影响显著。对比液料比、提取时间、提取温度三者的F值也能看出,液料比的影响最大,其次为提取时间,提取温度影响最小。

2.3.2 响应面交互作用分析与优化 根据拟合函数,通过Design Expert 8.0.5软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析,以叶绿素溶出量为响应值的响应面图见图5～图7。响应面曲面的坡度可反映该因素对叶绿素溶出量影响的强弱程度[15],响应曲面相对平缓,说明可以容忍处理条件的变异。

图5 液料比与提取时间对叶绿素溶出量的响应面Fig.5 Response surfaces of chlorophyll dissolution under the liquid to solid ratio and extraction time

图6 液料比与提取温度对叶绿素溶出量的响应面Fig.6 Response surfaces of chlorophyll dissolution under the liquid to solid ratio and extraction temperature

图7 提取时间与提取温度对叶绿素溶出量的响应面Fig.7 Response surfaces of chlorophyll dissolution under extraction time and temperature

由图5～图7等高线图形可知,存在极值的条件应该在圆心处,该模型在实验范围内存在稳定点,响应值存在最大值。由各响应面立体图可看出,料液比响应面曲面的坡度较提取时间和提取温度陡峭,表明液料比主效应大于提取时间和提取温度,与统计结果相符。

通过软件分析计算得出芹菜废弃茎叶叶绿素提取的理论最佳实验条件是:液料比20.33mL/g,提取时间76.83min,提取温度50.52℃,在此条件下,叶绿素溶出量的理论值达到9.796mg/g。为检验响应面法所得结果的可靠性,采用上述优化后的条件进行验证。考虑到实际操作的限制,将工艺条件调整到液料比20mL/g,提取时间75min,提取温度50℃,通过3次平行实验,实测叶绿素溶出量为9.629mg/g,与理论值相比,其相对误差为1.70%。因此,采用响应面法优化得到的提取条件参数准确可靠,具有实用价值。

3 结论

本文确定了超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素的最佳工艺,建立了超声波辅助提取芹菜废弃茎叶叶绿素的二次项数学模型,通过方差分析,该模型显著,所得方程拟合度良好,置信度较高。影响芹菜废弃茎叶叶绿素提取的各因素主次顺序为液料比>提取时间>提取温度,考虑到实际生产的需要,确定其最佳提取工艺条件为:液料比20mL/g,提取时间75min,提取温度50℃。在此条件下叶绿素实际溶出量为9.629mg/g,与理论值(9.796mg/g)无显著性差异,说明通过响应分析法得到的回归方程可较好地预测实验结果。本实验为进一步开发利用芹菜废弃茎叶资源提供了科学的理论依据。

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Technology for extracting chlorophyll from discarded stemsand leaves ofApiumgraveolensby ultrasonic-assisted method

YIN Yan,FENG Wei-hong,YANG Dao-lan,WANG Jian-xu,ZHANG Yan,WANG Yong-lin*

(Agricultural Science and Technology Research Extension Center of Lanzhou,Lanzhou 730010,China)

The discarded stems and leaves ofApiumgraveolensare rich in natural chlorophyll,and extraction of chlorophyll from abundantApiumgraveolensstems and leaves can not only alleviate the shortage of chlorophyll resources but also be beneficial for environmental protection. The chlorophyll was extracted by the method of organic-solution with the ultrasonic-assisted treatment and the Box-Behnken design combined with single factor experiments was used to optimize ultrasonic-assisted extraction of chlorophyll. The results showed that the optimal technological parameters were as follows,liquid to solid ratio of 20mL/g for 75min at 50℃. Under these experimental conditions,the predicted chlorophyll content was 9.796mg/g,the verification extraction yield was 9.629mg/g.

Apiumgraveolenswastes;chlorophyll;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

2014-09-22

尹燕(1983-),女,硕士，助理农艺师,研究方向：农产品加工及贮藏。

*通讯作者:王永林(1969-),男，本科，高级农艺师，研究方向：食品加工。

甘肃省科技支撑计划项目(1304FKCA060);兰州市科技计划项目(2012-2-139)。

TS255.36

B

1002-0306(2015)13-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.041