黄芩素对人胆囊癌细胞系SGC996细胞活力及细胞锌指X染色体蛋白表达的干预作用

陈虹

黄芩素对人胆囊癌细胞系SGC996细胞活力及细胞锌指X染色体蛋白表达的干预作用

陈虹

目的 探讨中药黄芩提取物黄芩素对人胆囊癌的生物效应及机制。方法 将人胆囊癌细胞系SGC996用黄芩素处理48h，采用MTT法检测治疗后SGC996的细胞活力；通过对透过transwell膜的SGC996细胞进行计数，评估黄芩素对胆囊癌侵袭转移能力的影响；通过流式细胞术检测黄芩素处理后，SGC996细胞的凋亡情况，并用Western blot方法检测细胞锌指X染色体蛋白（ZFX）的表达。结果 40、80、160、320μmol/L黄芩素组对SGC996细胞活力的抑制率与对照组比较，差异有统计学意义 [（19.3±3.8）%、（37.9±5.8）%、（61.6±7.8）%、（84.2±10.2）%比0，P＜0.05]。40、80、160μmol/L黄芩素组对SGC996细胞的凋亡诱导率与对照组比较，差异有统计学意义 [（7.5± 1.2）%、（16.3±1.9）%、（31.2±2.8）%比（0.5±0.5）%，P＜0.05]。40、80、160μmol/L黄芩素组对SGC996细胞转移抑制率与对照组比较，差异有统计学意义[（25.6±6.6）%、（57.3±7.9）%、（84.1±11.9）%比0，P＜0.05]。Western blot结果显示，黄芩素对ZFX有显著的抑制作用。结论 黄芩素有良好的抗胆囊癌生物活性，其抗肿瘤效应的机制可能与下调ZFX蛋白表达有关。

人胆囊癌细胞系；SGC996；黄芩素；细胞锌指X染色体蛋白；细胞活力

胆囊癌是一种恶性程度较高的消化系统肿瘤，具有肿瘤早期即发生淋巴结侵袭及远端转移的特征，较难治愈[1-2]。早期胆囊癌患者往往无症状或仅为轻微腹部不适，约90%的患者在确诊为胆囊癌时已进入中晚期，失去手术机会[3]。因此，药物治疗是目前治疗胆囊癌的主要手段。黄芩素是从天然药物黄芩根部提取的主要活性成分，具有抗过敏，抗菌，抗病毒的功效，研究还发现黄芩素可能有抗肿瘤的作用[4]，因此本研究的目的在于探讨黄芩素对胆囊癌的抗肿瘤效应及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胆囊癌SGC996细胞系来源于上海中科院细胞库，培养在DMEM培养基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/mL链霉素，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 实验试剂 DMEM培养基购于美国Gibco公司。黄芩素，噻唑蓝（MTT），AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒购于美国Sigma公司。细胞锌指X染色体蛋白（ZFX）抗体及β-actin抗体购于美国cell signaling公司。ZFX siRNA合成于广州锐博生物有限公司。转染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。BCA试剂盒和ECL试剂盒购于美国Pierce公司。

1.3 MTT试验 将SGC996细胞按5×103个/孔接种于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培养，设置3个复孔，并分别以10、20、40、80、160、320μmol/L的黄芩素培养48h，对照组为不加黄芩素同样条件培养48h。之后加20μL 5mg/mL MTT培养4h。弃上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD黄芩素组）/OD对照组×100%。

1.4 SGC996细胞侵袭转移能力检测 在transwell小室中接种1×104个SGC996细胞置于24孔板中，上室培养基为无血清DMEM培养基并分别加入40、80、160μmol/L黄芩素，下室培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养48h后取出transwell小室，用生理盐水洗去小室内的细胞，将transwell膜用3%多聚甲醛固定 15min后用 0.1%结晶紫染色20min，低倍镜（100×）观察4个随机选择的区域，计算细胞总数。SGC996细胞转移抑制率用以下公式计算：抑制率=（对照组细胞数目-黄芩素组细胞数目）/对照组细胞数目×100%。

1.5 细胞凋亡试验 SGC996细胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法检测。在SGC996细胞培养体系中分别加入40、80、160μmol/L黄芩素培养48h，对照组为不加黄芩素同样条件培养48h，收集细胞，生理盐水清洗一次，按照试剂说明书将PI和Annexin V加入细胞中孵育20min，用生理盐水清洗3次后采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡。细胞凋亡率用Annexin V阳性细胞占所有细胞比值表示。

1.6 Western blot试验 在SGC996细胞培养体系中分别加入40、80、160μmol/L黄芩素培养48h，对照组为不加黄芩素同样条件培养48h，细胞裂解后用BCA试剂盒进行定量，取50μg蛋白质在12.5%的丙烯酰胺中进行SDS-PAGE，之后将凝胶取下将蛋白转膜到PVDF膜上。将膜在ZFX一抗或β-actin一抗中孵育过夜，之后在带辣根过氧化物酶活性的二抗稀释液中孵育2h，ECL试剂显色曝光，于暗室中曝光X胶片，以ZFX与β-actin蛋白条的灰度比值表示蛋白的相对表达水平。

1.7 细胞转染 ZFX siRNA序列为：正向：5'-ACAAGGAUCAAUUUCCGACUU-3'；反向：5'-GUCGGAAAUUGAUCCUUGUUU-3'。无关RNA序列为正向：5'-ACCGUGGAUAAUCACCAAUUU-3'；反向：5'-AUUGGUGAUUAUCCACGGUUU-3'。待SGC996细胞生长到80%密度时按Lipofectamine2000产品说明书要求将100nmol/L的ZFX siRNA或无关对照siRNA转染入SGC996细胞中培养16h，之后换新鲜培养基并加入40μmol/L的黄芩素再培养48h，检测细胞活力、凋亡水平和细胞转移抑制率。

1.8 统计学方法 所有实验重复3次，实验数据用均数±标准差（±s） 表示，应用SPSS12.0统计软件进行处理，采用非配对双边t检验以及单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素对胆囊癌细胞系SGC996细胞活力的影响 MTT结果表明黄芩素在体外浓度达到40μmol/L以上时即显示显著的抗胆囊癌效应（P＜0.05），提示黄芩素对肿瘤细胞的杀伤作用且呈剂量依赖性，见表1。

表1 不同浓度黄芩素对SGC996细胞活力的影响（±s）

表1 不同浓度黄芩素对SGC996细胞活力的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

对照组10μmol/L黄芩素组20μmol/L黄芩素组40μmol/L黄芩素组80μmol/L黄芩素组160μmol/L黄芩素组320μmol/L黄芩素组3 3 3 3 3 3 3 0 10 20 40 80 160 320 0 0.4±0.9 4.2±1.5 19.3±3.8* 37.9±5.8* 61.6±7.8* 84.2±10.2*

2.2 黄芩素对胆囊癌细胞系SGC996侵袭转移能力及凋亡程度的影响 transwell实验和凋亡检测实验表明黄芩素能显著降低SGC996的转移能力并诱导肿瘤发生凋亡（P＜0.05），见表2。

2.3 黄芩素下调胆囊癌细胞系SGC996ZFX蛋白表达 黄芩素可显著下调SGC996ZFX蛋白的表达水平，见图1。为了研究ZFX蛋白与黄芩素抗胆囊癌效应的关系，我们应用小RNA（siRNA）基因沉默技术，下调SGC996细胞的ZFX水平，并将40μmol/L黄芩素加入到细胞培养体系中，检测ZFX基因沉默后黄芩素对SGC996细胞的抑制作用。结果发现单独转染ZFX siRNA也能抑制SGC996的细胞活力和转移能力，并诱导细胞的凋亡，而ZFX siRNA联合黄芩素则可发挥协同作用，显著杀伤SGC996细胞，见表3。

表2 黄芩素体外对SGC996侵袭转移能力及凋亡程度的影响（±s）

表2 黄芩素体外对SGC996侵袭转移能力及凋亡程度的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组40μmol/L黄芩素组80μmol/L黄芩素组160μmol/L黄芩素组孔数3 3 3 3黄芩素浓度（μmol/L）0 40 80 160转移抑制率（%）0 25.6±6.6* 57.3±7.9* 84.1±11.9*凋亡诱导率（%）0.5±0.5 7.5±1.2* 16.3±1.9* 31.2±2.8*

表3 ZFX siRNA对黄芩素发挥抗肿瘤效应的影响（±s）

表3 ZFX siRNA对黄芩素发挥抗肿瘤效应的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与黄芩素组比较，#P＜0.05；与ZFX siRNA组比较，△P＜0.05；ZFX：细胞锌指X染色体蛋白

组别对照组黄芩素组ZFX siRNA组ZFX siRNA联合黄芩素组孔数ZFX siRNA（nmol/L）3 3 3 3 0 0无关siRNA（nmo/L）100 100 100 100 0 0黄芩素浓度（μmol/L）0 40 0 40细胞活力抑制率（%）0 17.8±2.5* 20.6±4.4* 74.3±6.2*#△转移抑制率（%）0 26.8±5.9* 37.1±6.9* 90.4±15.2*#△凋亡诱导率（%）0.6±0.3 7.1±1.1* 12.3±2.2* 38.2±4.1*#△

图1 黄芩素对SGC996 ZFX表达水平的影响注：1.对照组；2.40μmol/L黄芩素组；3.80μmol/L黄芩素组；4.160μmol/L黄芩素组；ZFX：细胞锌指X染色体蛋白

3 讨论

黄芩素是目前广泛使用的天然药物活性成分，毒副作用较小，它良好的抗肿瘤效应越来越被重视。研究[5]表明黄芩素可显著下调口腔癌细胞cyclin D1的表达，从而诱导肿瘤细胞周期阻滞，抑制细胞的增殖；黄芩素还可明显降低DMBA-TPA对小鼠皮肤癌的诱导作用[6]；此外，黄芩素还能在体外显著抑制卵巢癌细胞的增殖[7]。本研究发现黄芩素具有显著的体外抗胆囊癌效应，能显著抑制肿瘤细胞的细胞活力，减弱肿瘤细胞的侵袭转移能力并诱导胆囊癌细胞发生程序性死亡。

锌指X染色体蛋白（ZFX）是一种核转录因子，基因位于X染色上。ZFX调控细胞的自我更新，在正常情况下维持胚胎和造血干细胞的分裂增殖[8]。研究发现ZFX在多种肿瘤细胞，如肺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤细胞的增殖、转移并帮助细胞逃避凋亡信号[9-11]。本研究发现黄芩素可显著下调ZFX的表达水平，推断黄芩素抗胆囊癌的机制可能和ZFX有关。为了研究ZFX在胆囊癌中的作用，我们用siRNA对ZFX基因进行沉默，结果发现ZFX siRNA有类似黄芩素的抗SGC996作用，而将ZFX siRNA和黄芩素同时作用于SGC996细胞时，肿瘤细胞的活力和转移能力受到极大的抑制，细胞凋亡程度显著提高，表明两者有协同作用。这些结果都支持了黄芩素杀伤SGC996细胞依赖于ZFX的下调这一观点。综上所述，本研究结果提示黄芩素有潜在的抗胆囊癌生物效应，其机制可能为下调细胞内锌指X染色体蛋白的表达水平，为胆囊癌的药物治疗提供了新的途径和理论依据。

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（收稿：2015-02-04 修回：2015-03-06）

Effect of Baicalein on Cell Activity and the Expression of ZFX Protein in Human Gallbladder Cancer CellLine SGC996

CHEN Hong.Department of Pharmacy,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To explore the effect of baicalein extracted from Scutellaria Baicalensis Georgi on gallnladder cercinoma and the underlying mechanism.M ethods SGC996 cells were treated with baicalein for 48 h and then were detected for cell viability by MTT assay.Cancer metastasis was evaluated by transwell assay.The apoptosis of SGC996 cells was measured by flow cytometry.The expression of ZFX protein in baicalein-treating SGC996 cells was detected with western blot.Results The cell viability inhibitory rate of SGC996 cells in 40,80, 160,and 320μmol/L baicalein groups were 19.3%±3.8%,37.9%±5.8%,61.6%±7.8%,and 84.2%±10.2%,with a significant difference as compared with control group（0,P＜0.05）.The apoptosis rate of SGC996 cells in control group and 40,80,and 160μmol/L baicalein groups were 0.5%±0.5%,7.5%±1.2%,16.3%±1.9%,and 31.2%±2.8%（P＜0.05）;the inhibitory rate of metastasis in these groups were 0,25.6%±6.6%,57.3%±7.9%,84.1%±11.9%（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the expression of ZFX protein in SGC996 cells was significantly suppressed by baicalein.Conclusion Baicalein showed a significant anti-tumor effect on human gallbladder cancer. The mechanism may be due to the down-regulation of ZFX.

human gallbladder cancer cell line;SGC996;baicalein;ZFX;cell viability

杭州市第一人民医院药剂科（杭州 310006）