地高辛通过上调RGS2表达以减缓AngⅡ诱导小鼠高血压性心肌肥厚发生发展的研究＊

廖耀行，董念国，魏战杰，李华东，张 沛，刘金平△

1华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科，武汉 430022

2澳门镜湖医院普外科，中国澳门 999078

地高辛通过上调RGS2表达以减缓AngⅡ诱导小鼠高血压性心肌肥厚发生发展的研究＊

廖耀行1，2，董念国1，魏战杰1，李华东1，张 沛1，刘金平1△

1华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科，武汉 430022

2澳门镜湖医院普外科，中国澳门 999078

目的 通过观察地高辛（Digoxin）干预血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的Apo小鼠高血压性心肌肥厚模型后，对G蛋白调节因子2（regulator of G protein signaling 2，RGS2）的影响，探讨地高辛治疗高血压性心肌肥厚的作用与可能的机制。方法 30只雄性Apo小鼠随机分为对照组、AngⅡ模型组和AngⅡ＋Digoxin治疗组。所有小鼠从术前1d至术后处死前均接受0.5%二甲基亚砜或地高辛溶液腹腔注射治疗，并且在术后28d获取心脏组织，通过组织学检查、苏木精－伊红（HE）染色切片分析技术评定心肌组织形态学变化、RGS2的mRNA及蛋白表达水平来评价地高辛的作用。结果 与AngⅡ模型组相比，AngⅡ＋Digoxin组全心重量、左心室壁厚度、心肌细胞直径均明显减少（P＜0.05或P＜0.01），RGS2mRNA变化不明显，而蛋白表达增高（P＜0.01），心肌肥厚明显减轻。同时检测小鼠在术前3d，手术当天，术后3、7、14、28d的血压，发现AngⅡ＋Digoxin组与AngⅡ模型组比较，术后7d和14d血压下降（均P＜0.05），术后28d则差异无统计学意义。结论 地高辛可能通过上调Apo小鼠高血压心肌肥厚模型RGS2的表达，有效减轻心肌肥厚，这说明地高辛可能在抑制心肌细胞肥大中起重要作用。

地高辛； G蛋白调节因子2； 血管紧张素Ⅱ； 心肌肥厚

心肌肥厚除了作为心脏后负荷增加的初期适应性生理反应，也是诸多心血管疾病（如高血压病、心脏瓣膜病、心肌病等）的共同病理生理过程。近期有研究发现G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路与高血压和心脏疾病有密切关系［1］，G蛋白调节因子2（RGS2）是GPCR内源性的调节者，是Gq家族中具有相对选择性的GTP酶激活蛋白［2］，介导血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）等缩血管因子相关的信号通路。在RGS2表达下调时，可以刺激苯肾上腺素（phenylephrine）和内皮素（endothelin）的分泌，导致心肌细胞的PLC－β通路激活，从而增强促心肌肥大作用［3］，导致心肌肥厚的发生。而最近的研究亦证实RGS2能负向调节由β肾上腺素受体介导的心肌肥厚，表明RGS2在高血压诱导的心肌肥厚中起保护作用［4］。另一项最新的研究指出，洋地黄类药物在血管平滑肌细胞中可通过转录后调控机制减慢RGS2蛋白的降解，增加RGS2蛋白表达水平［5］，从而有利于减轻心肌肥厚。然而，在AngⅡ诱导的高血压性心肌肥厚模型中，洋地黄类的作用并未得到研究证实。因此我们构建AngⅡ诱导小鼠高血压性心肌肥厚模型，并通过地高辛干预对二者可能存在的关系及相关机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料

地高辛（Digoxin）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma－Aldrich公司；RGS2（10678－1－AP）、RGS 4（14530－1－AP）抗体均购自美国PTG公司；内参β－actin抗体（SC－1616R）购自美国SANTA公司；Trizol Reagent购自上海Invitrogen生物工程公司；逆转录试剂盒购自Thromo公司；微量渗透泵（ALZET Osmotic Pumps，Model－2004）购自美国Durect公司；小鼠智能无创血压计（型号Softron BP－2010A），倒置显微镜（型号CKX31，OLYMPUS公司）。

1.2 动物模型建立及分组

1.3 实验步骤及方法

1.3.1 地高辛的配制及各组给药方式 治疗用地高辛溶液于每天腹腔注射前避光配制，按每只小鼠1.6mg／（kg·d）的剂量溶于0.5%DMSO配制为混合液。AngⅡ＋Digoxin治疗组于术前1d开始给予地高辛－0.5%DMSO混合溶液腹腔注射，对照组、AngⅡ模型组每天给予等体积0.5%DMSO溶液腹腔注射，处死时间均为术后第28天。

1.3.2 尾夹法测定小鼠血压 采用Softron BP－2010 A小鼠无创血压测定仪测定各组小鼠术前3d血压，手术当天及术后3、7、14、28d血压，测定前在小鼠安静、清醒状态下将传感器套在小鼠尾部，通过充气、放气对尾动脉加压和释压的同时监测血流信号，得出尾动脉血压值，收缩压（SBp）、舒张压（DBp）和平均动脉压（MBp），连续测量3次，取其平均值。

1.3.3 全心重量指数测定 小鼠称取体重，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死，开胸后迅速取出小鼠心脏，小心游离心旁组织，注意避免用镊子触碰心脏，避免破坏组织结构，用4℃冷生理盐水冲洗血液后，用吸水纸吸干水分，称取全心重量，然后截取部分用多聚甲醛固定，余放入液氮保存作检测之用。收集数据计算平均全心重量及全心重量指数，判断心脏肥厚的程度。

1.3.4 心脏形态学检测 将4%多聚甲醛固定的心脏组织制成石蜡切片，取左心室横截面心肌环，常规苏木精－伊红（HE）染色后拍照，利用Image－pro plus5.0图像分析软件测量左心室壁厚度，并计算左室壁平均厚度，然后在显微镜下放大400倍后再拍照，每张切片随机选取20个视野，每个视野选20个心肌细胞，用Image－pro plus5.0软件测量每个心肌细胞的直径，并计算其平均值。

1.3.5 RGS2、RGS4蛋白表达 取心脏组织约10 mg，组织块用冷TBS洗涤2～3次，清除血液，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积RIPA裂解液试剂冰上彻底匀浆。将匀浆液转移至1.5mL EP离心管中，振荡。冰浴30min，期间不断反复吹打，确保组织细胞完全裂解。12 000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。采用Bradford方法测定，测完蛋白含量后，计算含40μg蛋白的溶液体积即为点样量，在10%分离胶中进行电泳，电泳结束后将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上进行湿转，5%的脱脂奶粉室温封闭1h。加入按照1∶1 000稀释倍数的兔抗鼠多克隆抗体β－actin及1∶500稀释倍数的兔抗鼠多克隆抗体RGS2、RGS4孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次5min，加入按照1∶3 000比例稀释的HRP标记山羊抗兔抗体，室温孵育30min后，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min，将A和B两种试剂在离心管中等体积混合，将膜蛋白面朝上与此混合液充分接触，放入暗匣中曝光，最后用显影、定影试剂进行显影和定影。用Image图像处理软件分析各目的蛋白和内参电泳条带的灰度值，将RGS2、RGS4目的条带灰度值与同一样本内参的灰度值相比得出RGS2、RGS4的相对表达水平。

1.4 统计学方法

统计分析用SPSS 22.0统计软件完成，组间均数比较采用独立样本t检验，各组之间的差异采用One－way ANOVA分析，各组计量资料以表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏重量及镜下形态观察

术后28d，解剖小鼠，取出心脏称重并对部份心脏组织进行甲醛固定，行HE染色，切片分别在低倍镜测量各组左心室壁厚度，高倍镜测量各组心肌细胞直径。一部分心脏组织放入液氮保存，用于分子生物学检测。

表1结果显示，各组间小鼠体重未见明显差异（P＞0.05）；在全心重量上，AngⅡ＋Digoxin治疗组较AngⅡ模型组减轻（P＜0.01），且更接近对照组；在左室壁厚度及左室心肌细胞直径上，AngⅡ＋Digoxin治疗组较AngⅡ模型组有所减小（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组小鼠测量结果比较（s）Table1 Comparison of the measurement results of mice in different groups（s）

表1 各组小鼠测量结果比较（s）Table1 Comparison of the measurement results of mice in different groups（s）

与AngⅡ模型组比较，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

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在体外标本肉眼观可见AngⅡ模型组小鼠心脏体积明显增大，且质地较AngⅡ＋Digoxin治疗组小鼠心脏坚硬。低倍镜中可见心脏心室横切面中AngⅡ＋Digoxin治疗组比AngⅡ模型组的室间隔增厚有明显减轻，而在高倍镜下，心肌细胞水平可见AngⅡ模型组心肌细胞肥大明显，AngⅡ＋Digoxin治疗组可见心肌细胞肥大明显减轻。见图1。

图1 AngⅡ模型组与AngⅡ＋Digoxin治疗组心脏标本及组织学表现Fig.1 Gross and histological examination of the hearts in AngⅡmodel group and AngⅡ＋Digoxin treatment group

2.2 RGS2和RGS4蛋白表达

由图2可见，Western blot法检测小鼠心脏组织中RGS2与RGS4的蛋白表达以及各组间相对比值的比较。对照组与AngⅡ模型组间差异无统计学意义，地高辛治疗后小鼠心脏组织RGS2的蛋白表达明显上调，与AngⅡ模型组及对照组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），而检测各组间心脏组织中的RGS4水平基本不变（均P＞0.05），说明RGS4不受地高辛药物干预的影响。此结果证明地高辛能有效提高RGS2蛋白的表达。

图2 小鼠心脏RGS2和RGS4蛋白表达Fig.2 Protein expressions of RGS2and RGS4in the hearts of mice

2.3 血压监测

在血压－收缩压方面，AngⅡ模型组和AngⅡ＋Digoxin治疗组在术后3d开始升高，在术后7、14、28d血压升高明显，两组在术后7、14d血压差异有统计学意义（均P＜0.05），但到术后28d，两组血压差异无统计学意义。见表2。

在血压－平均动脉压方面，AngⅡ模型组和AngⅡ＋Digoxin治疗组在术后7、28d差异均无统计学意义，而术后14d两组间平均动脉压差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 各组小鼠血压－收缩压测量结果（，mmHg）Table2 The measurement results of systolic blood pressure in the three groups（s，mmHg）

表2 各组小鼠血压－收缩压测量结果（，mmHg）Table2 The measurement results of systolic blood pressure in the three groups（s，mmHg）

与AngⅡ模型组比较，＊P＜0.05

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表3 各组小鼠血压－平均动脉压测试结果（，mmHg）Table3 The measurement results of the mean arterial blood pressure in the three groups（s，mmHg）

表3 各组小鼠血压－平均动脉压测试结果（，mmHg）Table3 The measurement results of the mean arterial blood pressure in the three groups（s，mmHg）

与AngⅡ模型组比较，＊P＜0.05

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3 讨论

本实验中，AngⅡ＋Digoxin治疗组中RGS2蛋白表达较对照组与AngⅡ模型组明显升高，而各组间RGS4的表达未见明显差异，这表明地高辛能有效增加RGS2蛋白在心肌组织中的表达。通过全心重量、左心室壁厚度、心肌细胞直径的比较，我们发现AngⅡ＋Digoxin治疗组比AngⅡ模型组有明显的减少（P＜0.05或P＜0.01）。AngⅡ模型组、AngⅡ＋Digoxin治疗组中血压在术后3d开始升高，到术后7d时明显比对照组增高，尤其是AngⅡ模型组平均达到140mmHg以上，而AngⅡ＋Digoxin治疗组中血压亦达到135mmHg左右，但升高幅度比AngⅡ模型组相对要小，这提示注射地高辛后，可能减缓AngⅡ刺激血管平滑肌细胞作用。而AngⅡ＋Digoxin治疗组与AngⅡ模型组血压在术后7、14d差异有统计学意义（均P＜0.05）。虽然在术后7、14、28d中，AngⅡ＋Digoxin治疗组比AngⅡ模型组平均血压有5～10mmHg下降，这提示地高辛有一定的降压作用，但与对照组比较，则降血压效果不明显。

本实验采用AngⅡ诱导ApoE－／－小鼠心肌肥厚的发生，其致病机制为ApoE－／－小鼠多伴发有主动脉管壁粥样硬化病变，使后负荷增加［6］；而AngⅡ作用于血管平滑肌细胞中的AT1，导致血压升高，增加心脏后负荷［7］，令心脏做功增加，引起心肌肥厚；另外，AngⅡ亦可作用于心肌细胞，刺激其肌蛋白合成，引起心肌细胞肥大，同时刺激心肌成纤维细胞的增殖、基质胶原蛋白合成和沉积，诱导心肌纤维化［7］，而导致左室心肌肥厚。

RGS2在高血压及心力衰竭中扮演重要角色，在RGS2基因敲除小鼠中，儿茶酚胺介导的心肌肥厚作用明显加强、并减弱对压力负荷的耐受而导致心功能不全，与对照组比较小鼠压力负荷耐受减弱后，心脏舒张末内径扩张明显，射血分数同时降低［8］，这提示RGS2在压力负荷所引致的心脏肥大中起关键作用；RGS2－／－小鼠同时伴有高血压、阻力血管的持续收缩，其机制与增加Ca2＋内流，损害NO途径及增加交感系统张力有关［9］。过量表达的RGS2抑制Gαq／11蛋白介导的心肌细胞肥大［10］，而内源性的RGS2可以抑制血管紧张素介导心脏成纤维细胞的信号转导、胶原合成及细胞增殖［1112］。有研究揭示地高辛可以通过一种后转录机制减缓蛋白质的降解，从而增加心脏和肾脏中RGS2蛋白水平，这证实地高辛可以起到对抗高血压以及心肌肥厚的作用［5］。我们通过研究发现，在AngⅡ诱导的小鼠高血压性心肌肥厚模型中，地高辛干预对RGS4的表达无明显影响，却显著提升了RGS2表达，明显减缓心肌肥厚的发生发展过程。

鉴于造模成本，很多研究中多采用两肾一夹肾血管高血压性或主动脉缩窄性心肌肥厚模型。相对于上述创伤操作，皮下AngⅡ微量渗透泵诱导高血压性心肌肥厚模型更符合该疾病的人体病理生理过程。虽然洋地黄类药物目前并不推荐用于肥厚性心肌病，然而作为为数不多的RGS2蛋白正向调节剂，在高血压诱导的心肌肥厚模型中仍是值得探究的。

目前地高辛作为典型的洋地黄类药物广泛地应用在房颤、心功能不全等治疗中。因为目前并没有可供临床应用的成品化外源性RGS2蛋白，所以该研究为我们提示了一个通过药物抑制心肌肥厚的新思路，同时为更有效、更倾向于临床应用的洋地黄类衍生物的开发提供了依据。

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（2014－04－09 收稿）

Digoxin Alleviates AngⅡ－induced Cardiac Hypertrophy by Increasing the Expression of RGS2

Liao Yaohang1，2，Dong Nianguo1，Wei Zhanjie1et al
1Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China
2Department of Greneral Surgery，Kiang Wu Hospital，Macao 999078，China

Objective To examine the effect of digoxin on the expression of regulator of G protein signaling 2（RGS2）in apolipoprotein E－deficient（ApoE－／－）mice with angiotensinⅡ－induced cardiac hypertrophy and further explore the possible mechanism by which digoxin treats hypertensive cardiac hypertrophy.Methods Thirty male ApoE－／－mice were randomly divided into the following 3groups:Control group，AngⅡmodel group，AngⅡ＋Digoxin treatment group.All mice were intraperitoneally treated with 0.5%DMSO or digoxin from the day before operation to the day before sacrifice.Twenty－eight days after the operation，heart samples were harvested.The morphological changes of the cardiac tissues were evaluated by histopathological examination and HE staining，respectively.The protein and mRNA levels of RGS2were determined to reflect the efficacy of digoxin.Results The whole heart weight，the thickness of the left ventricular posterior wall，and the myocyte diameter were significantly decreased in the AngⅡ＋Digoxin treatment group as compared with those in the AngⅡmodel group（P＜0.05for the thickness of the left ventricular posterior wall；P＜0.01for the whole heart weight and the myocyte diameter）.The protein level of RGS2was significantly increased in the AngⅡ＋Digoxin treatment group as compared with that in the AngⅡmodel group（P＜0.01），although the RGS2mRNA level wasn’t significantly differ between the groups.Cardiac hypertrophy was profoundly improved in the AngⅡ＋Digoxin treatment group.Furthermore，by monitoring the blood pressure at 3days before operation，on the day of operation，and at 3，7，14，28days after operation，we found that digoxin delayed the increase of blood pressure at day 7and day 14after operation but not at day 28.Conclusion Digoxin could effectively attenuate cardiac hypertrophy in ApoE－／－mice by upregulating the RGS2expression，suggesting the important role of digoxin in the suppression of cardiac hypertrophy.

digoxin； regulator of G protein signaling 2（RGS2）； angiotensinⅡ； cardiac hypertrophy

R542

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.004

＊国家自然科学基金资助项目（No.81270322）

廖耀行，男，1987年生，医学硕士，E－mail:jing6161117＠gmail.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:jinping＠hust.edu.cn