某市蒙古族与汉族肺腺癌EGFR基因突变的分析

孟令茹 袁晓荣 曹 坤 杨雪洁 金 娜

（内蒙古包头市肿瘤医院，内蒙古 包头 014030）

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，WHO统计每年新发肺癌病例120万例，死亡110万例[1]。其中，非小细胞肺癌约占肺癌的80%左右，大部分患者就诊时已是晚期，总体5年生存率仅约15%。随着标准一线化疗方案疗效出现了瓶颈，表皮生长因子酪氨酸及酶抑制剂（EGFR-TKIs）的临床应用使晚期非小细胞肺癌EGFR突变患者得以延长生存期、提高生活质量。而表皮生长因子酪氨酸及酶抑制剂的应用有赖于EGFR基因突变检测，以提高用药有效率。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种受体型酪氨酸激酶，在许多肿瘤中过表达和(或)发生突变，通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移等密切相关，这些特点使其成为一个有潜力的肿瘤靶向治疗分子[2]。本文旨在研究内蒙古包头市蒙古族非小细胞肺腺癌患者与汉族非小细胞肺腺癌患者EGFR突变率是否存在差异，为内蒙古包头市蒙古族晚期非小细胞肺腺癌患者个体化治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料：收集包头市各医院蒙古族肺腺癌患者石蜡包埋组织标本53例，其中男性33例，女性22例；年龄41～75岁，中位年龄59岁。汉族肺腺癌患者石蜡包埋组织标本55例，其中男性39例，女性16例；年龄38～76岁，中位年龄58岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与DNA提取：石蜡包埋标本中肿瘤组织占标本总体积的70%，采用病理石蜡切片样品，切取10张石蜡包埋标本切片，每张面积＞10 mm×10 mm、厚度5～10 μm，（所用含有肿瘤组织的蜡块切片保存时间不超过两年）。常规石蜡切片，烤干后二甲苯脱蜡，无水乙醇浸泡再流水冲洗，干燥后显微切割去除坏死组织，转组织于Eppendorf管中，加消化缓冲液及蛋白酶K溶液，然后60 ℃水浴8～16 h，离心后取上清，加酚/氯仿(1∶1)混匀，离心取上清，加无水乙醇，-20 ℃放置后再离心弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温晾干后用ddH2O重新溶解沉淀，取1 μL测定浓度和纯度，其余-80 ℃保存。

1.2.2 PCR扩增和测序：实时荧光PCR扩增 采用ARMS （amplification refractory mutation system，ARMS）方法进行PCR扩增，检测EGFR基因外显子18、19、20和21突变。用厦门艾德生物医药科技公司EGFR基因突变检测试剂盒进行检测，实验具体操作步骤参照试剂盒说明书进行操作。采用StrataGene MX3000P实时PCR仪进行扩增，每次检测样品包括1个阳性质控品、1个NTC对照。如果Ct值为0或Ct值>30，则实验结果判为野生型。所述荧光PCR的反应条件：95 ℃预变性5 min，1个循环；95 ℃变性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，15个循环；93 ℃变性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31个循环。

1.3 统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

检测108例肺腺癌的样本，包括53例内蒙古包头市蒙古族和55例汉族肺腺癌的样本。有46例EGFR基因突变，总突变率为42.59%。其中蒙古族突变22例，突变率为41.51%；汉族突变24例，突变率为43.64%。见表1。

表1 蒙古族与汉族EGFR基因突变统计结果

其中外显子18检测到EGFR基因突变1例，为汉族；外显子19 检测到EGFR基因突变34例，其中蒙古族16例、汉族18例；外显子20 检测到EGFR基因突变2例，其中蒙古族1例、汉族1例；外显子21检测到EGFR基因突变9例，其中蒙古族5例、汉族4例。外显子19和外显子21同时EGFR基因突变4例，其中蒙古族2例、汉族2例。见表1。

在外显子19所检测到34例EGFR基因突变中共有8种不同的突变形式，最常见核苷酸缺失起始位2235为14例，其中蒙古族为6例，汉族为8例；缺失起始位2238为5例，其中蒙古族为2例，汉族为3例。而核苷酸缺失终止位2249为9例，其中蒙古族为5例，汉族为4例。在外显子21所检测到9例EGFR基因突变中，其位点为2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸（CTG→CGG，L858R）的为8例，蒙古族为3例，汉族为5例，二者的突变率无明显差异。

3 讨 论

表皮生长因子（EGF）及其位于细胞膜上的受体EGFR是一种跨膜蛋白质，是酪氨酸激酶erbB/HER家族的一个成员，主要由细胞外的结合区，跨膜区及酪氨酸激酶组成的细胞内区等3个区域组成。EGFR的异常可导致其下游信号途径的异常激活，最终促使细胞的转化、增殖、抵抗细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。因此，EGFR成为肿瘤治疗的重要靶分子。EGFR-TKI可阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长，用于非小细胞肺癌的治疗。非小细胞肺癌对EGFR-TKI的敏感性与肺癌组织EGFR基因的突变呈密切相关。对药物敏感的突变位点主要集中在外显子18～21，约90%的突变集中在第19和第21外显子，通过结构分析表明，该区域的突变改变了EGFR结构，影响多种蛋白激酶的自身调节[4-5]。

大规模临床试验已表明酪氨酸激酶抑制剂gefitinib]和erlotinib[6-8]在晚期非小细胞肺癌中的疗效和生存上的优势。文献报道[9]，不同人种之间EGFR突变率不尽相同，东亚人群EGFR突变率30%左右，高加索人10%左右。Li等[10]通过对202例肺腺癌患者发现，我国汉族人的肺腺癌EGFR突变率为75.3%。单莉等[11]通过对68例维吾尔族和70例汉族肺腺癌样本检测发现维吾尔族肺腺癌EGFR突变率明显低于我国汉族EGFR基因突变。而本研究显示，内蒙古地区蒙古族肺腺癌EGFR突变与汉族肺腺癌EGFR突变表达无明显差异，二者同样适用EGFR-TKI治疗。

肺癌组织EGFR基因的突变中约90%的突变集中在第19和第21外显子。本研究45例EGFR基因突变中检测到33例外显子19基因突变，共有8种不同的突变形式，最常见核苷酸缺失起始位2235为14例，其中蒙古族为6例，汉族为8例，缺失起始位2238为6例，其中蒙古族为3例，汉族为3例，而核苷酸缺失终止位2249为11例，其中蒙古族为5例，汉族为6例，二者均无统计学差异。在外显子21所检测到9例EGFR基因突变中，其位点为2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸（CTG→CGG，L858R）的为8例，蒙古族为3例，汉族为5例，二者的突变率无明显差异。

综上所述，本研究表明内蒙古包头市蒙古族肺腺癌患者EGFR基因突变率与汉族EGFR基因突变率无统计学差异。非小细胞肺癌对EGFR-TKI的敏感性与肺癌组织EGFR基因的突变呈密切相关，基于EGFR的突变情况来选择EGFR-TKIs的药物进行化疗已成为临床医师的共识，本研究首次提供内蒙古包头市蒙古族肺腺癌EGFR突变率信息，可以为临床医师提供有益参考，使广大肺腺癌患者受益。

[1] Zhou QH.Progress in early diagnosis and screening of lung cancer[J].Chin Cancer,2009,18(9):705-712.

[2] Jorissen RN,Walker F,Pouliot N,et al.Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signaling[J].Exp Cell Res,2003,284(1):31-53.

[3] Yarden Y.The EGFR family and its ligands in human cancer signaling mechanisms and therapeutic opportunities[J].Eur J cancer,2001,37(Suppl4):3-8.

[4] Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med,2004,350(21):2129-2139.

[5] Dickson NR,Hainsworth JD,Bradof D,et al.Single agent gefitinib in poor performance status patients with previously untreated advanced non-small lung cancer:A Minnie Pearl Cancer Research Network phase Ⅱ study [J].Proc Am Soc Clin Oncol,2004,23(634):7086.

[6] Fukuoka M,Yano S,Giaccone G,et al.Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer(TheIDEAL 1 Trial)[J].J Clin Oncol,2003,21(12): 2237-2246.

[7] Kris MG,Natale RB,Herbst RS,et al.Efficacy of gefitinib,an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase,in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: a randomized trial[J].JAMA,2003,290(16):2149-2158.

[8] Thatcher N,Chang A,Parikh P,et al.Gefitinib plus best supportive care in previously treated patients with refractory advanced non-small-cell lung cancer: results from a randomized,placebocontroller,multicentre study(Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer)[J].Lancet,2005,366(9496):1527-1537.

[9] Wu YL,Zhong WZ,LiL Y,et al.Epidermal growth factor receptor mutations and Their correlation with Gefitinib thera-py in patients with non-small cell lung cancer:A meta-a-nalysis based on updated individual patient data from six medical centers In mainland China[J]. J Thorac Oncol,2007,2(5):430-439.

[10] Li C,Fang R,Sun Y,et al.Spectrum of oncogenic driver mutations in lung adenocarcinomas from East Asian never smokers[J].PLoS One,2011,6(11): e28204.

[11] 单莉,张琰,赵峰,等.维吾尔族肺腺癌患者的EGFR基因突变分析[J].中国肺癌杂志,2013,16(2):78-81.