胸腺五肽对重症肌无力的药效分析

陈阳

重症肌无力属于一种因传递功能障碍（神经-肌肉接头处）所致的自身免疫性疾病，临床表现为骨骼肌无力（部分或全身）、易疲劳，症状在活动后加重，经过休息后症状减轻。该病患病率在77/100万~150/100万，年发病率在4/100万~11/100万，可发生在任何年龄段，以1~5岁儿童多见。临床治疗该病方法较多，但疗效不够理想，尚无公认标准治疗方案[1]。从发病机制方面研究，重症肌无力发生、进展中T细胞、胸腺起到重要作用，出现自身免疫性疾病和抑制性的T细胞活性下降，导致免疫调节性的T细胞亚群失衡，致使B细胞过多产生自身抗体相关[2]。所以，治疗重症肌无力应考虑对T细胞亚群进行调节，使之平衡。胸腺五肽是由五种氨基酸（酪氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸、精氨酸）组成。诱导T细胞分化是其作用之一，具有免疫调节功能。对于免疫力低下者，动物整体实验或离体实验证实，胸腺五肽可诱导T细胞分化，使外周T淋巴细胞活化，具有免疫调节活性[3]。本研究以免疫荧光技术检测胸腺五肽对重症肌无力小鼠T淋巴细胞亚群产生的影响，并与其他组别对照，以分析胸腺五肽对重症肌无力的药效，现具体报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 选取30只雌性小鼠（C57BIJ6），8周龄，平均体重（19.55±1.24）g（提供单位：北京市维通利华动物有限公司）。将所有小鼠随机分为治疗组（2 d给1次药）、模型对照组、正常对照组，每组各10只。合成多肽（26肽链），TP-5序列（提供单位：深圳翰宇生物有限公司）。完全福氏佐剂（提供单位：美国Sigma公司）。BBC裂解液（提供单位：北京中杉金桥生物技术有限公司）。黏片剂，一抗CD4、CD8，二抗（提供单位：天津灏洋生物有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 给药情况 所有小鼠均在清洁级条件下进行喂养管理，治疗组免疫成为重症肌无力模型后，给药操作为胸腺五肽，0.25 mg/次（药液容积0.5 mL），2 d给1次药，持续用药2周；模型对照组免疫成为重症肌无力模型后，给药操作以等量生理盐水代替药物；正常对照组的免疫、给药操作均以等量生理盐水代替药物[4-5]。

1.2.2 建立重症肌无力模型 制备第1次免疫注射乳剂，把20 μg合成多肽（26肽链）溶于100 mL PBS缓冲液（pH 7.2），加入等量完全弗氏佐剂，混合充分直至油滴吸附油滴吸附全部水溶液。第1次选取背部6处和两后肢垫，每处注射20 μL，选取尾基部注射40 μL。制备第2次免疫注射乳剂，把20 μg合成多肽（26肽链）溶于50 mL PBS缓冲液（pH 7.2），加入等量完全弗氏佐剂，混合充分直至油滴吸附油滴吸附全部水溶液。在第1次注射4周后进行第2次注射，选取背部3处每处注射20 μL，选取尾基部注射40 μL。重症肌无力症状通常会在注射2周后出现[6-7]。

1.2.3 提取T细胞 内眦取血1 mL，置入离心管（5 mL）中，4 ℃环境静置30 min，以3000转速离心10 min，去血清。将RBC裂解液（1.5 mL）加入到沉淀血细胞内，翻转混匀，在15 ℃环境静置15 min，期间进行1~2次混匀，以2500转速离心10 min，去清液；以PBS溶液反复洗涤，以2500转速离心10 min，直到沉淀内红色消失。加入PBS溶液（100 μL），制成T细胞悬液，4 ℃环境静置备用[8]。

1.2.4 CD4+、CD8+细胞计数 取T细胞悬液（5 μL）均匀涂到载玻片（已加粘片剂）上，晾干。在载玻片上滴加固定剂，2~3 min后，以PBS溶液洗涤，之后晾干。载玻片上加一抗后，置于湿盒内，37 ℃环境培养30 min，以PBS溶液洗涤，之后晾干。载玻片上加二抗后，置于湿盒内，37 ℃环境培养30 min，以PBS溶液洗涤，之后晾干。以扫描显微镜（Univar）分光光度计拍照，以配套软件对CD4+、CD8+细胞计数[9]。1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x-±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组免疫后用药治疗前体重比较 三组免疫后用药治疗前体重如下：治疗组为（21.42±1.53）g，模型对照组为（21.38±1.46）g，正常对照组为（19.91±1.30）g。与正常对照组比较，治疗组和模型对照组的体重均明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 三组T淋巴细胞亚群中CD4+、CD8+细胞计数、比值比较 在免疫、用药治疗后，CD4+（%）结果：正常对照组<治疗组<模型对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；CD8+（%）结果：治疗组<正常对照组<模型对照组，但三组比较差异无统计学意义（P>0.05）；CD4+/CD8+比值结果：正常对照组<治疗组<模型对照组，与模型对照组比较，正常对照组和治疗组比值接近，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 三组T淋巴细胞亚群中CD4+、CD8+细胞计数、比值比较（x-±s）

3 讨论

胸腺生成素Ⅱ中的胸腺五肽为其活性中心，具有其所有活性，胸腺五肽和胸腺生成素Ⅱ一样，具有双向免疫调节的功能，使T细胞内CD4+/CD8+比值保持在合理范围内。重症肌无力属于自身免疫性疾病，有细胞免疫依赖性补体参与，胸腺内T淋巴细胞（nAChR致敏）参与周围循环，通过白细胞介素、肿瘤坏死因子、Y-干扰素等细胞因子，导致nAChR抗体在B细胞中产生。本实验中，在实验小鼠体内注入nAChR活性中心的合成多肽（26肽链）后，使小鼠体内大量结合T淋巴细胞（具有nAChR表型），促进CD4细胞的分化、增殖，使外周血内CD4+计数增加，CD4+会产生细胞因子，刺激nAChR抗体在B细胞中产生。而胸腺生成素会在重症肌无力小鼠体内产生调节T细胞分化的作用，使CD4+计数减少。即得到CD4+（%）结果：正常对照组<治疗组<模型对照组（P<0.05）。而CD8+（%）结果：治疗组<正常对照组<模型对照组，但三组比较无显著性差异（P>0.05），提示胸腺生成素会在重症肌无力小鼠体内产生使CD8+计数减少。CD4+/CD8+比值结果为重症肌无力治疗中的观察指标，CD4+/CD8+比值结果：正常对照组<治疗组<模型对照组，与模型对照组比较，正常对照组和治疗组比值接近。提示胸腺生成素在重症肌无力小鼠体内生产双向免疫调节作用，使CD4+、CD8+计数降低[10]。

综上所述，胸腺五肽对重症肌无力的药效显著，可进行免疫调节。

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